Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Impacto de la producción de piomelanina en especies de Pseudomonas promotoras del crecimiento vegetal |
| Título alternativo: | Impact of pyomelanin production on plant growth-promoting Pseudomonas species |
| Autor: | Saad, Ezequiel |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
|
| Fecha de defensa: | 2025-02-24 |
| Fecha en portada: | Febrero 2025 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Químicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Química Biológica |
| Director: | Tribelli, Paula María |
| Director Asistente: | Díaz Appella, Mateo Nicolás |
| Jurado: | Sacco, Natalia Jimena; Galello, Fiorella Ariadna; Petrillo, Ezequiel |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nQUI000012_Saad |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nQUI000012_Saad.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nQUI000012_Saad |
| Ubicación: | Dep.QUI 000012 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Saad, Ezequiel. (2025). Impacto de la producción de piomelanina en especies de Pseudomonas promotoras del crecimiento vegetal. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nQUI000012_Saad |
Resumen:
El género Pseudomonas es conocido por su amplia distribución en hábitats naturales y su notable versatilidad metabólica. Al igual que muchos otros organismos, algunas Pseudomonas son capaces de producir melanina, una familia de pigmentos heteropoliméricos de color marrón oscuro y estructura compleja, cuya síntesis deriva comúnmente del metabolismo de aminoácidos aromáticos. Además, estos pigmentos poseen interés clínico y biotecnológico ya que están asociados con un aumento de la resistencia a factores de estrés como la presencia de antibióticos, especies reactivas de oxígeno (ROS) y la radiación ultravioleta (UV), entre otros. Dentro de las melaninas, se encuentra el grupo de las piomelaninas, derivadas de la acumulación del homogentisato (HMG), intermediario en el catabolismo oxidativo de la tirosina. Frecuentemente, esta acumulación se debe a mutaciones inactivantes en el gen hmgA que codifica la enzima responsable de la conversión de HMG a 4-maleilacetoacetato. Por otro lado, el género Pseudomonas también incluye especies de importancia agrícola que generan efectos positivos para los cultivos al asociarse con las raíces de las plantas, denominadas rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR, por sus siglas en inglés). En este sentido, se han estudiado las distintas funciones bacterianas que conllevan un beneficio para el crecimiento vegetal como la biodisponibilización de nutrientes, la biosíntesis de hormonas vegetales y el biocontrol sobre microorganismos patógenos. Las PGPR deben ser capaces de sobrevivir y competir exitosamente con la comunidad microbiana presente en la rizósfera. Este entorno está caracterizado por la presencia de distintas fuentes de estrés, tanto bióticas como abióticas, frente a las cuales la producción de piomelanina podría representar una importante ventaja competitiva. Sin embargo, el impacto de esta característica en especies bacterianas empleadas como inoculantes no ha sido estudiado hasta el momento. En esta tesis se analizaron los efectos de la producción de piomelanina en las características de promoción del crecimiento vegetal de dos especies del género Pseudomonas: P. protegens Pf-5 y P. extremaustralis 14-3b. Para esto, se construyó una mutante melanogénica a partir de la cepa salvaje de P. protegens Pf-5 mediante la inactivación del gen hmgA utilizando un sistema CRISPR-Cas modificado. Además, se utilizó una cepa productora de piomelanina de P. extremaustralis 14-3b obtenida por transposición al azar en trabajos previos desarrollados en nuestro laboratorio. Se realizaron curvas de crecimiento en medio líquido de P. protegens Pf-5 salvaje y melanogénica sin registrar diferencias en la dinámica de crecimiento de estas cepas. Además, se caracterizaron los pigmentos sintetizados por las variantes melanogénicas de P. protegens Pf-5 y P. extremaustralis 14-3b mediante la determinación de sus espectros de absorción en el UV-visible. Se observaron diferencias particularmente en la región UV (200-400 nm), lo que podría ser un indicio de diferencias estructurales entre los pigmentos producidos por cada cepa. Se evaluó la capacidad de las piomelaninas purificadas de las variantes melanogénicas de P. protegens Pf-5 y P. extremaustralis 14-3b para brindar resistencia frente a la radiación UV-C. Para esto se tomaron células libres de sobrenadante de las cepas salvaje y melanogénica de P. protegens Pf-5, se las resuspendió en medio PBS suplementado o no con piomelanina purificada de P. protegens Pf-5 o P. extremaustralis 14-3b y se las sometió a distintos tiempos de exposición a radiación UV-C. Ambos pigmentos brindaron protección frente a la radiación UV-C, siendo la piomelanina de P. extremaustralis 14-3b la que mostró un efecto protector mayor. Para determinar el impacto de la producción de piomelanina en la resistencia al estrés oxidativo, se llevó a cabo un ensayo de sensibilidad al peróxido de hidrógeno (H2O2 ) en medio sólido. Mientras que en el caso de P. protegens Pf-5 la cepa pigmentada demostró ser significativamente más tolerante al H2O2 que la variante salvaje, no se observó un efecto significativo de la producción de piomelanina en P. extremaustralis 14-3b sobre este fenotipo. Se determinó la capacidad de formación de biofilms en superficie plástica de las cepas salvajes y melanogénicas mediante la técnica de cristal violeta. Para el caso de P. extremaustralis, no se observaron diferencias significativas entre cepas en esta característica. Por el contrario, la variante melanogénica de P. protegens Pf-5 mostró una formación de biofilm aproximadamente cinco veces menor que la de la cepa Pf5-wt. Paralelamente, ensayos preliminares de colonización de raíces in vivo en la planta modelo Arabidopsis thaliana mostraron un escenario diferente. Cualitativamente, la variante salvaje de P. extremaustralis 14-3b fue la cepa con mayor adhesión y desarrollo de biofilm sobre las raíces de A. thaliana, mientras que la cepa mutante y ambas variantes de P. protegens Pf-5 presentaron una adhesión menor y similar entre ellas. Se realizó un experimento de solubilización de fosfato en placa, utilizando el medio NBRIP. No se observaron diferencias en la solubilización de fosfato entre las variantes melanogénicas y salvajes para ninguna de las dos especies. Se estudiaron los efectos de la inoculación con suspensiones de P. extremaustralis 14-3b, tanto en su variante salvaje como mutante, en la arquitectura radical de A. thaliana. La cepa melanogénica generó un aumento en la densidad y longitud de las raíces laterales, así como en la longitud de los pelos radicales de A. thaliana de manera similar a la cepa salvaje. Sin embargo, se observaron diferencias significativas entre las cepas en relación a su efecto sobre la longitud de la raíz principal. Mientras que la inoculación con la cepa salvaje provocó una reducción del tamaño de la misma, el tratamiento con la cepa mutante no mostró diferencias significativas respecto al control no inoculado. Los resultados de este trabajo indican que la producción de piomelanina es capaz de conferir ventajas frente a factores de estrés, como la radiación UV y el estrés oxidativo, importantes para aumentar la supervivencia en la rizósfera de especies bacterianas empleadas como bioinoculantes. Sin embargo, la síntesis de estos pigmentos puede tener efectos adversos en características deseables en bacterias promotoras del crecimiento vegetal, como la formación de biofilms. A su vez, los efectos de la producción de piomelanina pueden depender de la especie analizada, lo que resalta la importancia de estudiar esta característica en distintos microorganismos de interés agrícola.
Abstract:
The genus Pseudomonas is known for its wide distribution in natural habitats and remarkable metabolic versatility. Like many other organisms, some Pseudomonas species can produce melanin, a family of dark brown polymeric pigments with a complex structure, commonly synthesized from the metabolism of aromatic amino acids. These pigments are of clinical and biotechnological interest as they are associated with increased resistance to stress factors such as antibiotics, reactive oxygen species, and ultraviolet (UV) radiation, among others. Within the different types of melanins, there is the group of pyomelanins, derived from the accumulation of homogentisate (HMG), an intermediate in the oxidative catabolism of tyrosine. In certain cases, such as reported in clinical isolates of P. aeruginosa, this accumulation is due to inactivating mutations in the hmgA gene, which encodes the enzyme responsible for converting HMG to 4-maleylacetoacetate. Additionally, the genus Pseudomonas includes species of great importance in agriculture that benefit crops by associating with plant roots, known as plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR). In this context, various bacterial functions that benefit plant growth have been studied, such as nutrient bioavailability, biosynthesis of plant hormones, and biocontrol of pathogenic microorganisms. PGPR must survive and compete successfully within the rhizosphere microbial community, an environment characterized by multiple stress factors, such as those mentioned above, against which pyomelanin production may provide a significant competitive advantage. However, the impact of this trait on bacterial species used as inoculants has not yet been studied. In this thesis, the effects of pyomelanin production on the plant growth-promoting traits of two Pseudomonas species, P. protegens Pf-5 and P. extremaustralis 14-3b, were analyzed. For this purpose, a melanogenic mutant was constructed from the wild-type strain of P. protegens Pf-5 by inactivating the hmgA gene using a modified CRISPR-Cas system. Additionally, a pyomelanin-producing strain of P. extremaustralis 14-3b obtained through random transposition in previous work from our laboratory was used. Growth curves were performed in liquid media for P. protegens Pf-5 wild-type and melanogenic strains without observing differences in their growth dynamics. Furthermore, the pigments synthesized by the melanogenic variants of P. protegens Pf-5 and P. extremaustralis 14-3b were characterized by determining their UV-visible absorption spectra. Differences were observed particularly in the UV region (200-400 nm), which could indicate structural differences between the pigments produced by each strain. The capacity of purified pyomelanins from the melanogenic variants of P. protegens Pf-5 and P. extremaustralis 14-3b to provide resistance to UV-C radiation was evaluated. To this end, cells from the wild-type and melanogenic strains of P. protegens Pf-5 were harvested, resuspended in PBS medium supplemented (or not) with purified pyomelanin from P. protegens Pf-5 or P. extremaustralis 14-3b, and exposed to different UV-C radiation exposure times. Both pigments provided protection against UV-C radiation, with the pyomelanin from P. extremaustralis 14-3b showing a greater protective effect. To determine the impact of pyomelanin production on oxidative stress resistance, a hydrogen peroxide (H2O2) sensitivity assay was conducted in solid medium. In the case of P. protegens Pf-5, the pigmented strain was significantly more tolerant to H2O2 than the wild-type variant, whereas no significant effect of pyomelanin production was observed in P. extremaustralis 14-3b regarding this phenotype. The ability of wild-type and melanogenic strains to form biofilms on plastic surfaces was also compared using the crystal violet technique. In the case of P. extremaustralis, the melanogenic strain exhibited a biofilm formation capacity similar to the wild-type strain. Conversely, the melanogenic variant of P. protegens Pf-5 displayed a biofilm formation capacity approximately five times lower than that of the wild-type strain. Additionally, a preliminary in vivo root colonization assay was performed in the model plant Arabidopsis thaliana, revealing a different scenario. Qualitatively, the wild-type P. extremaustralis 14-3b strain exhibited the highest adhesion and biofilm development on A. thaliana roots, whereas the mutant strain and both P. protegens Pf-5 variants showed lower and similar adhesion levels. A phosphate solubilization assay on plates using NBRIP medium was conducted, revealing no differences in phosphate solubilization between the melanogenic and wild-type variants for either species. The effects of inoculation with P. extremaustralis 14-3b suspensions, both wild-type and mutant, on A. thaliana root architecture were studied. The melanogenic strain induced an increase in lateral root density and length, as well as in A. thaliana root hair length, similar to the wild-type strain. However, significant differences were observed between the strains regarding their effect on primary root length. While inoculation with the wild-type strain caused a reduction in primary root size, treatment with the mutant strain did not show significant differences compared to the uninoculated control. The results of this work indicate that pyomelanin production can confer advantages against stress factors, such as UV radiation and oxidative stress, important for enhancing survival in the rhizosphere of bacterial species used as bioinoculants. However, the synthesis of these pigments may have adverse effects on desirable traits in plant growth-promoting bacteria, such as biofilm formation. Moreover, the effects of pyomelanin production may depend on the species analyzed, highlighting the importance of studying this characteristic in different microorganisms relevant to agriculture.
Citación:
---------- APA ----------
Saad, Ezequiel. (2025). Impacto de la producción de piomelanina en especies de Pseudomonas promotoras del crecimiento vegetal. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nQUI000012_Saad
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Saad, Ezequiel. "Impacto de la producción de piomelanina en especies de Pseudomonas promotoras del crecimiento vegetal". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nQUI000012_Saad
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