Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Impacto de las mutaciones en Staphylococcus aureus en su interacción con Pseudomonas aeruginosa : rol del metabolismo del hemo |
| Título alternativo: | Impact of mutations in Staphylococcus aureus on its interaction with Pseudomonas aeruginosa : role of heme metabolism |
| Autor: | Galeano, Mariana Belén |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Fecha de defensa: | 04-12-2025 |
| Fecha en portada: | 2025 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Departamento Docente: | Departamento de Química Biológica |
| Director: | Tribelli, Paula María |
| Director Asistente: | Palomino, María Mercedes |
| Consejero: | Zorreguieta, Ángeles |
| Jurado: | Galván, Estela María; Sisti, Federico Bernardo; Sieira, Rodrigo |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | STAPHYLOCOCCUS AUREUS; PSEUDOMONAS AERUGINOSA; HIERRO; COINFECCION; VIRULENCIASTAPHYLOCOCCUS AUREUS; PSEUDOMONAS AERUGINOSA; IRON; COINFECTION; VIRULENCE |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7872_Galeano |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7872_Galeano.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7872_Galeano |
| Ubicación: | QUI 007872 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Galeano, Mariana Belén. (2025). Impacto de las mutaciones en Staphylococcus aureus en su interacción con Pseudomonas aeruginosa : rol del metabolismo del hemo. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7872_Galeano |
Resumen:
Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, son capaces de generar infecciones polimicrobianas en pacientes inmunodeprimidos, dispositivos médicos o pacientes con fibrosis quística (FQ); estas dos bacterias pueden interactuar de forma competitiva, coexistiendo o incluso cooperando metabólicamente. La competencia entre S. aureus y P. aeruginosa por nutrientes y el nicho ecológico está afectada por componentes tanto de las envolturas como citosólicos y secretados, muchos de los cuales aún no se comprenden en su totalidad. Este trabajo se centró en primer lugar en caracterizar la interacción entre P. aeruginosa (PAO1 principalmente) y cepas mutantes de S. aureus USA300 afectados genes relacionados con distintos procesos celulares tales como metabolismo lipídico, del hemo y envolturas (lrgA; uppP; tagB y hssR). La cepa mutante en el gen hssR, que codifica para el regulador HssR involucrado en la homeostasis de hemo, mostró resultados fenotípicos relevantes en comparación con la cepa salvaje como una disminución de actividad DNAsa y hemolítica, una menor formación de biofilms y una menor resistencia a estrés oxidativo sumado a un aumento en la sensibilidad al antibiótico cefoxitina (FOX). El hierro es un nutriente esencial para la supervivencia bacteriana y en el contexto infeccioso la adquisición de hierro juega un papel fundamental. S. aureus es capaz de lisar glóbulos rojos obteniendo hierro a partir de moléculas de hemo, sin embargo, la acumulación de hemo puede provocar citotoxicidad por estrés oxidativo, por lo que la homeostasis de este compuesto es relevante. Además, el crecimiento de esta cepa en condiciones aeróbicas en medio suplementado con hemina (fuente de hemo) fue significativamente menor que la cepa salvaje, mientras que estas diferencias no se observaron a partir de las 10 horas en condiciones microaeróbicas aún en presencia de hemina. Dados estos resultados sumados a la relevancia de la homeostasis de hierro, los estudios de esta tesis se enfocaron en la mutante hssR y su interacción con P. aeruginosa. La supervivencia en mono y cultivos cultivos fue evaluada en medio rico comercial (TSB), en medio esputo artificial (ASM) tanto en condiciones de aerobiosis como microaerobiosis en presencia o ausencia de hemina determinando la supervivencia, la presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS), la producción de ácidos orgánicos y otros parámetros fenotípicos de interés. Los resultados más relevantes en cuanto a la supervivencia de S. aureus en ausencia de hemina fueron la disminución en condiciones aeróbicas de 5 y de 3.7 veces en cocultivos de PAO1-hssR respecto a cultivos PAO1-salvaje. En medio ASM no se observaron diferencias significativas en ausencia de hemina independientemente de la aireación. Sin embargo, en medios suplementados con hemina la supervivencia de S.aureus en medio TSB mostró tanto en condiciones aeróbicas como microaerobicas una disminución de la cepa hssR de más de 10 veces respecto a la cepa salvaje en cultivos con PAO1. Estos resultados fueron diferentes en el caso del medio ASM, en el cual en condiciones de microaerobiosis la diferencia en la supervivencia de la cepa hssR respecto a la salvaje fue de 15 veces (similar al medio TSB) mientras que en condiciones aeróbicas fue solo de 1,6 veces. Además cultivos microaerobicos realizados en medio ASM en presencia de hemina pero en ausencia de PAO1 (monocultivos) mostraron una caída de 13 veces para la cepa mutante, indicando que la hemina tiene un impacto severo en el crecimiento de S. aureus en medio ASM independientemente de la presencia de PAO1. Se realizaron ensayos para determinar los mecanismos fisiológicos que podrían estar involucrados en la disminución de la supervivencia de la cepa hssR en cocultivos. Se realizó la determinación de la formación de especies reactivas de oxígeno mediante citometría de flujo, determinando que en medio ASM en presencia de hemina (en condiciones microaerobicas) hay una producción significativamente mayor de ROS en cocultivos hssR-PAO1. Por otro lado, la determinación de ácidos orgánicos relacionados con el metabolismo oxidativo (succinato) y la fermentación (formiato, lactato y acetato) mostró una compleja relación entre los mismos y las condiciones de cultivo con una disminución de la producción de acetato en la cepa hssR cuando se cocultiva con PAO1 en condiciones de microaerobiosis. Los resultados muestran una alteración en el metabolismo de la cepa hssR que afecta funciones relacionadas con la virulencia como la formación de biofilms, la hemólisis así como la morfología de las células determinada por microscopía de transmisión electrónica, sin embargo estos ensayos fueron realizados en ensayos in vitro, por lo que se realizaron también ensayos en el modelo animal de D. melanogaster. En este modelo la cepa hssR generó menor mortalidad a lo largo de los días que la cepa salvaje, sin comprometer su crecimiento hasta las 9 horas post infección, sugiriendo una disminución en la virulencia en un modelo animal. Por último y dado que la interacción entre estas dos especies tiene impacto en coinfecciones en pacientes con FQ, se evaluaron las secuencias aminoacídicas (deducidas de la secuencia nucleotídica) tanto de aislamientos de S. aureus provenientes de pacientes pediátricos con diagnóstico de FQ, tanto monoinfectados con S. aureus como coinfectados con S. aureus y P. aeruginosa. HssR se mostró conservado, mientras que HssS presentó múltiples mutaciones, lo que podría afectar el funcionamiento del sistema sensor-respuesta. En conjunto, los resultados demuestran que hssR modula la competencia interbacteriana, la sensibilidad antibiótica y la virulencia de S. aureus en contextos de coinfección, y destacan el rol del sistema HssRS como factor adaptativo relevante en entornos pulmonares complejos.
Abstract:
Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa are capable of causing polymicrobial infections in immunocompromised patients, medical devices, or patients with cystic fibrosis (CF); these two bacteria can interact competitively, coexisting or even cooperating metabolically. Competition between S. aureus and P. aeruginosa for nutrients and ecological niche is affected by components of both the envelopes and cytosols and secretions, many of which are not yet fully understood. This work focused primarily on characterizing the interaction between P. aeruginosa (mainly PAO1) and mutant strains of S. aureus USA300 affected genes related to different cellular processes such as lipid, heme, and envelope metabolism (lrgA; uppP; tagB, and hssR). The mutant strain in the hssR gene, which encodes the HssR regulator involved in heme homeostasis, showed relevant phenotypic results compared to the wild strain, such as decreased DNase and hemolytic activity, reduced biofilm formation, and reduced resistance to oxidative stress, in addition to increased sensitivity to the antibiotic cefoxitin (FOX). Iron is an essential nutrient for bacterial survival, and in the context of infection, iron acquisition plays a fundamental role. S. aureus is capable of lysing red blood cells to obtain iron from heme molecules; however, heme accumulation can cause cytotoxicity due to oxidative stress, making the homeostasis of this compound relevant. In addition, the growth of this strain under aerobic conditions in a medium supplemented with hemin (a source of heme) was significantly lower than that of the wild strain, while these differences were not observed after 10 hours under microaerobic conditions, even in the presence of hemin. Based on these results and the importance of iron homeostasis, the studies in this thesis focused on the hssR mutant and its interaction with P. aeruginosa. Survival in mono- and mixed cultures was evaluated in commercial rich medium (TSB) and artificial sputum medium (ASM) under both aerobic and microaerobic conditions, with and without hemin, determining survival, the presence of reactive oxygen species (ROS), the production of organic acids, and other phenotypic parameters of interest. The most relevant results regarding the survival of S. aureus in the absence of hemin were the decrease in aerobic conditions of 5 and 3.7 times in PAO1-hssR cocultures compared to PAO1 wild-type cultures. In ASM medium, no significant differences were observed in the absence of hemin regardless of aeration. However, in media supplemented with hemin, the survival of S. aureus in TSB medium showed a more than 10-fold decrease in the hssR strain compared to the wild-type strain in PAO1 cultures under both aerobic and microaerobic conditions. These results were different in the case of ASM medium, while under microaerobic conditions the difference in survival of the hssR strain compared to the wild strain was 15-fold (similar to TSB medium) and under aerobic conditions it was only 1.6-fold. In addition, microaerobic cultures performed in ASM medium in the presence of hemin but in the absence of PAO1 (monocultures) showed a 13-fold decrease for the mutant strain, indicating that hemin has a severe impact on the growth of S. aureus in ASM medium regardless of the presence of PAO1. Tests were performed to determine the physiological mechanisms that could be involved in the decreased survival of the hssR strain in cocultures. The formation of reactive oxygen species was determined by flow cytometry, establishing that in ASM medium in the presence of hemin (under microaerobic conditions) there is significantly higher ROS production in hssR-PAO1 cocultures. On the other hand, the determination of organic acids related to oxidative metabolism (succinate) and fermentation (formate, lactate, and acetate) showed a complex relationship between them and the culture conditions, with a decrease in acetate production in the hssR strain when cocultured with PAO1 under microaerobic conditions. The results show an alteration in the metabolism of the hssR strain that affects virulence-related functions such as biofilm formation, hemolysis, and cell morphology as determined by transmission electron microscopy. However, these tests were performed in vitro, so tests were also performed in the Drosophila melanogaster animal model. In this model, the hssR strain generated lower mortality over time than the wild strain, without compromising its growth up to 9 hours post-infection, suggesting a decrease in virulence in an animal model. Finally, given that the interaction between these two species has an impact on co-infections in patients with CF, the amino acid sequences (deduced from the nucleotide sequence) of S. aureus isolates from pediatric patients diagnosed with CF, both monoinfected with S. aureus and coinfected with S. aureus and P. aeruginosa, were evaluated. HssR was found to be conserved, while HssS showed multiple mutations, which could affect the functioning of the sensor-response system. Overall, the results demonstrate that hssR modulates interbacterial competition, antibiotic sensitivity, and virulence of S. aureus in coinfection contexts, highlighting the role of the HssRS system as a relevant adaptive factor in complex pulmonary environments.
Citación:
---------- APA ----------
Galeano, Mariana Belén. (2025). Impacto de las mutaciones en Staphylococcus aureus en su interacción con Pseudomonas aeruginosa : rol del metabolismo del hemo. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7872_Galeano
---------- CHICAGO ----------
Galeano, Mariana Belén. "Impacto de las mutaciones en Staphylococcus aureus en su interacción con Pseudomonas aeruginosa : rol del metabolismo del hemo". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7872_Galeano
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