Estudio de envolturas celulares de bacterias ácido lácticas : aplicaciones biotecnológicas de la proteína S-layer y endolisinas de fagos de lactobacilos

Gordillo, Tania Belén

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Estudio de envolturas celulares de bacterias ácido lácticas : aplicaciones biotecnológicas de la proteína S-layer y endolisinas de fagos de lactobacilos
Título alternativo:	Study of Cell Envelope Structures in Lactic Acid Bacteria : Biotechnological Applications of the S-layer Protein and Endolysins from Lactobacillus Phages
Autor:	Gordillo, Tania Belén
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
Fecha de defensa:	2025-07-30
Fecha en portada:	2025
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Departamento Docente:	Departamento de Química Biológica
Director:	Palomino, María Mercedes
Consejero:	López, Nancy Irene
Jurado:	Wetzler, Diana Elena; Serradell, María de los Ángeles; Magni, Christian
Idioma:	Español
Palabras clave:	BACTERIAS ACIDO LACTICAS; PROBIOTICOS; S-LAYER; ENDOLISINA; ESTRES OSMOTICO; β-GALACTOSIDASALACTIC ACID BACTERIA; PROBIOTICS; S-LAYER; ENDOLYSIN; OSMOTIC STRESS; β-GALACTOSIDASE
Formato:	PDF
Handle:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7791_Gordillo
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7791_Gordillo.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7791_Gordillo
Ubicación:	QUI 007791
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Gordillo, Tania Belén. (2025). Estudio de envolturas celulares de bacterias ácido lácticas : aplicaciones biotecnológicas de la proteína S-layer y endolisinas de fagos de lactobacilos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7791_Gordillo

Resumen:

Las bacterias ácido lácticas (BAL) han sido utilizadas por siglos en diversas aplicaciones humanas, por lo que muchas cepas de este grupo han obtenido el estatus de Generalmente Reconocidas como Seguras (GRAS). Además, muchas presentan propiedades probióticas, lo que significa que, al ser administradas en dosis adecuadas, contribuyen al bienestar del consumidor. Asimismo, estas bacterias pueden sobrevivir en el entorno hostil del tracto gastrointestinal, tolerando condiciones como bajo pH, alta concentración de sales biliares y la acción de proteasas. También tienen la capacidad de interactuar con células inmunitarias y adherirse a las mucosas, lo que las convierte en vehículos ideales para aplicaciones biotecnológicas. El objetivo de esta tesis fue desarrollar un sistema de exhibición de proteínas de interés biotecnológico en la superficie de BAL sin necesidad de modificaciones genéticas. Para ello, se evaluaron dos dominios como carriers: el dominio carboxilo terminal de la proteína S-layer de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 (CTSlpA) y el dominio de unión a la pared celular (CBD) de la endolisina del fago PL-1 (CBDLys). Ambos dominios fueron fusionados a la proteína verde fluorescente GFP y expresados en Escherichia coli como sistema heterólogo. Posteriormente, fueron utilizados para recubrir o “decorar” la superficie de las BAL en ensayos in vitro. El análisis de la proteína ancla CTSlpA reveló que, entre todas las BAL estudiadas, Lactobacillus acidophilus exhibe la mayor cantidad de proteína heteróloga. Las pruebas de tolerancia al estrés gastrointestinal mostraron que la retención de la unión se mantiene en valores superiores al 65%, sin comprometer la viabilidad celular. Asimismo, la evaluación de estrategias alternativas de decapado de S-layer, en comparación con la técnica tradicional con LiCl, demostró que el precrecimiento en MRS con NaCl seguido de decapado con NaCl permite retener el 75% del binding, reforzando la seguridad y eficacia de la plataforma de exhibición. El estudio del ancla CBDLys reveló que, a diferencia de CTSlpA, este dominio tiene la capacidad de unirse a BAL sin capa S, siendo Lacticaseibacillus paracasei ATCC 27092 la cepa con la mayor capacidad de unión. Con el objetivo de mejorar la adhesión sin afectar la viabilidad celular, se evaluó el crecimiento en condiciones de alta salinidad (NaCl). Esta estrategia resultó en un incremento significativo de la unión mediada por CBDLys, en correlación con modificaciones estructurales en la envoltura bacteriana. Entre estos cambios, se observó una reducción en el contenido de ácido lipoteicoico (LTA) y polisacáridos de pared celular (CWPS), así como una disminución en la O-acetilación del peptidoglicano (PG), lo que sugiere una mayor accesibilidad a los sitios de unión. También se evaluó la retención de la unión y la supervivencia mediante estudios de preservación a 4 °C y post-liofilización. La cepa decorada conservó la capacidad de unión tras la liofilización y mantuvo su viabilidad durante todo el período de estudio. Además, el decorado celular con la proteína heteróloga mejoró su estabilidad durante el almacenamiento a 4 °C. Con el fin de evaluar las propiedades de adhesión del sistema, se analizó la unión de las cepas decoradas con los respectivas quimeras en un sistema de adhesión a mucinas in vitro, examinando el efecto del tipo de crecimiento y el decorado con la proteína carrier. No se observaron diferencias significativas en la adhesión entre células decoradas y no decoradas cuando fueron cultivadas en condiciones estándar. Sin embargo, el crecimiento en alta salinidad generó una disminución significativa en la adhesión. En conjunto, estos hallazgos permitieron optimizar las condiciones para una aplicación. Como prueba de concepto, la β-galactosidasa, una enzima de gran interés biotecnológico e industrial, fue fusionada a los dominios ancla previamente caracterizados permitiendo su exhibición en la envoltura de las BAL en alta densidad. Este enfoque amplía sus posibilidades de uso en distintas aplicaciones, reforzando el potencial del sistema como una herramienta innovadora y versátil. Finalmente, en esta tesis se desarrolló un enfoque innovador para la exhibición de proteínas heterólogas en la superficie de bacterias ácido lácticas, a partir de las características estructurales y funcionales de las proteínas expuestas como plataforma para la entrega de proteínas o péptidos bioactivos. Este sistema permite la exhibición de proteínas de interés farmacéutico e industrial en cepas de la familia Lactobacillaceae de reconocidas características probióticas, ofreciendo una alternativa segura y eficiente. De modo tal de generar una formulación de grado alimentario y prescindiendo del uso de organismos genéticamente modificados, manteniendo de esta manera, el estatus seguro de los microorganismos empleados y ampliando su potencial aplicación en la industria biotecnológica.

Abstract:

Lactic acid bacteria (LAB) have been used for centuries in various human applications, and many strains of this group have achieved the status of Generally Recognized as Safe (GRAS). Additionally, many of these bacteria exhibit probiotic properties, meaning that when administered in adequate doses, they contribute to the consumer's well-being. Furthermore, these bacteria can survive in the harsh environment of the gastrointestinal tract, tolerating conditions such as low pH, high bile salt concentrations, and protease activity. They also have the ability to interact with immune cells and adhere to mucosal surfaces, making them ideal vehicles for biotechnological applications. The goal of this thesis was to develop a system for displaying biotechnologically relevant proteins on the surface of LAB without the need for genetic modifications. To achieve this, two domains were evaluated as carriers: the carboxy-terminal domain of the S-layer protein of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 (CTSlpA) and the cell wall-binding domain (CBD) of the endolysin from phage PL-1 (CBDLys). Both domains were fused to green fluorescent protein (GFP) and expressed in Escherichia coli as a heterologous system. They were then used to coat or "decorate" the surface of LAB in vitro assays. The analysis of the CTSlpA carrier revealed that, among all LAB studied, Lactobacillus acidophilus exhibited the highest amount of heterologous protein. Gastrointestinal stress tolerance tests showed that binding retention remained above 65%, without compromising cell viability. Additionally, the evaluation of alternative S-layer stripping strategies, compared to the traditional LiCl technique, demonstrated that pre-culturing in MRS with NaCl followed by stripping with NaCl allowed for the retention of 75% of binding, reinforcing the safety and efficacy of the display platform. The study of the CBDLys carrier revealed that, unlike CTSlpA, this domain can bind to LAB without the S-layer, with Lacticaseibacillus paracasei ATCC 27092 being the strain with the highest binding capacity. To improve adhesion without affecting cell viability, pre-culturing in high salinity conditions (NaCl) was evaluated. This strategy resulted in a significant increase in CBDLys-mediated binding, correlating with structural modifications in the bacterial envelope. Among these changes, a reduction in lipoteichoic acid (LTA) and cell wall polysaccharides (CWPS) was observed, as well as a decrease in the O-acetylation of peptidoglycan (PG), suggesting greater accessibility to binding sites. Binding retention and survival were also assessed through preservation studies at 4 °C and post-lyophilization. The decorated strain maintained its binding ability after lyophilization and retained its viability throughout the study period. Furthermore, cellular decoration with the heterologous protein improved stability during storage at 4 °C. To evaluate the adhesion properties of the system, the adhesion of decorated strains with the respective carriers was analyzed in an in vitro mucin adhesion system, examining the effect of pre-culturing in high salinity, growth conditions, and decoration with the carrier protein. No significant differences in adhesion were observed between decorated and non-decorated cells when grown under standard conditions. However, pre-culturing in high salinity resulted in a significant decrease in adhesion. Together, these findings allowed for the optimization of conditions for an application. As a proof of concept, β-galactosidase, an enzyme of great biotechnological and industrial interest, was fused to the previously characterized carrier domains, allowing its display on the surface of LAB at high density. This approach broadens its potential for use in various applications, reinforcing the potential of the system as an innovative and versatile tool. Finally, this thesis developed an innovative approach for displaying heterologous proteins on the surface of lactic acid bacteria, based on the structural and functional characteristics of the exposed proteins as a platform for the delivery of bioactive proteins or peptides. This system enables the display of pharmaceutical and industrially relevant proteins on strains of the Lactobacillaceae family, which are recognized for their probiotic characteristics, offering a safe and efficient alternative. This approach allows for the generation of food-grade formulations, without the use of genetically modified organisms, thereby maintaining the safe status of the microorganisms used and expanding their potential applications in the biotechnology industry.

Citación:

---------- APA ----------

Gordillo, Tania Belén. (2025). Estudio de envolturas celulares de bacterias ácido lácticas : aplicaciones biotecnológicas de la proteína S-layer y endolisinas de fagos de lactobacilos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7791_Gordillo

---------- CHICAGO ----------

Gordillo, Tania Belén. "Estudio de envolturas celulares de bacterias ácido lácticas : aplicaciones biotecnológicas de la proteína S-layer y endolisinas de fagos de lactobacilos". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7791_Gordillo

Estadísticas:

Descargas totales desde :

Navegar

Colección

Tesis Doctoral