Estudios biofísicos de la maquinaria del virus del dengue : nuevas estrategias antivirales

Sarto, Carolina

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Estudios biofísicos de la maquinaria del virus del dengue : nuevas estrategias antivirales
Título alternativo:	Biophysical studies of the dengue virus machinery : new antiviral strategies
Autor:	Sarto, Carolina
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Cálculo (IC)
Fecha de defensa:	2025-07-25
Fecha en portada:	25 de julio del 2025
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Inorgánica, Química Analítica y Química Física
Departamento Docente:	Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física
Director:	Arrar, Mehrnoosh
Consejero:	Scherlis Perel, Damián Ariel
Jurado:	Dans Puiggrós, Pablo Ignacio Daniel; Pickholz, Mónica Andrea; Castro, María Ana
Idioma:	Español
Formato:	PDF
Handle:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7780_Sarto
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7780_Sarto.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7780_Sarto
Ubicación:	QUI 007780
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Sarto, Carolina. (2025). Estudios biofísicos de la maquinaria del virus del dengue : nuevas estrategias antivirales. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7780_Sarto

Resumen:

Se estima que el virus del dengue es responsable de aproximadamente 390 millones de infecciones a nivel mundial. Actualmente no existe un tratamiento específico disponible y el desarrollo de vacunas se dificulta por la potenciación de virulencia dependiente de anticuerpos, generada por los cuatro serotipos de este virus que infectan a los seres humanos. El objetivo general de esta tesis es comprender mediante herramientas computacionales las relaciones entre estructura, dinámica y función de biomoléculas involucradas en el proceso de replicación del ARN viral, en donde la participación de las proteínas virales no estructurales 3 y 5 (NS3 y NS5, respectivamente) resulta indispensable. Durante el proceso de replicación, el dominio helicasa de la proteína NS3 (NS3hel) requiere hidrolizar ATP para poder desplazarse unidireccionalmente sobre el ARN viral, dejándolo disponible como cadena simple y facilitando su ingreso al sitio catalítico del dominio polimerasa de la proteína NS5. Esta última enzima sintetiza la cadena complementaria de ARN que servirá como molde para generar nuevas copias del ARN viral. Para poder comenzar la síntesis, la polimerasa debe unirse a un segmento estructurado no codificante del ARN viral, el 5’ Stem Loop A (SLA), que actúa como promotor específico, activando alostéricamente el sitio catalítico de la polimerasa. En esta tesis se abordan dos fenómenos centrales del contexto de la replicación: el acoplamiento entre las actividades helicasa y ATPasa de la NS3hel y la activación alostérica de la polimerasa NS5. Diversos trabajos han mostrado que la hidrólisis de ATP es necesaria para que la helicasa pueda desplazarse unidireccionalmente y separar la doble hebra de ARN y, a su vez, la presencia de ARN acelera la hidrólisis de ATP. A partir de simulaciones de dinámica molecular clásica, en un primer paso se exploró el espacio conformacional del complejo NS3hel-ARN y los posibles cambios según la ocupación del sitio catalítico. Como resultado principal, se observó la apertura del loop β6β1’, el cual genera un canal que favorece la salida del fosfato inorgánico del sitio catalítico y además, se observó que durante el ciclo de hidrólisis de ATP, la afinidad de la NS3hel por el ARN disminuye, permitiendo así el desplazamiento de la helicasa. En segundo lugar, se caracterizó el mecanismo mediante el cual ocurre la reacción química de hidrólisis de ATP de la NS3hel en presencia y ausencia de ARN. Para esto se empleó una descripción híbrida cuántica/clásica (QM/MM) y una búsqueda de caminos de mínima energía para comparar posibles mecanismos de reacción. Se observó que la presencia de ARN favorece una conformación del sitio catalítico que disminuye la barrera de activación para la reacción. Por último, se identificaron sitios aptos para la unión de pequeñas moléculas que son conservados en los cuatro serotipos y que pueden intervenir en los aspectos mecanísticos estudiados en la tesis. El otro fenómeno abordado en esta tesis es el reconocimiento molecular entre el SLA y la polimerasa de la NS5. Mediante simulaciones de DM clásica y un análisis basado en la teoría de grafos y redes dinámicas, se identificaron caminos alostéricos entre el sitio de unión del SLA a la NS5 y el sitio catalítico y como mutaciones puntuales en el SLA o la NS5 pueden intervenir en dichos caminos. Los resultados de esta tesis aportan información relevante para la comprensión de la maquinaria de replicación del virus del dengue a nivel molecular y permiten diseñar nuevas estrategias terapéuticas.

Abstract:

Dengue virus is estimated to be responsible for approximately 390 million infections worldwide. Currently, there is no specific treatment available, and vaccine development is challenging due to a phenomenon known as "antibody-dependent enhancement," which arises from the four serotypes of this virus that infect humans. The general aim of this thesis is to understand, through computational tools, the relationships between structure, dynamics, and function of biomolecules involved in the viral RNA replication process, where the participation of the non-structural viral proteins 3 and 5 (NS3 and NS5, respectively) is essential. During the replication process, the helicase domain of the NS3 protein (NS3hel) needs to hydrolyze ATP to move unidirectionally along the viral RNA, making it available as a single strand and facilitating its entry into the catalytic site of the polymerase domain of the NS5 protein. The latter enzyme synthesizes the complementary RNA strand that will serve as a template to generate new copies of the viral RNA. To initiate the synthesis, the polymerase must bind to a structured, non-coding segment of the viral RNA called Stem Loop A (SLA), which acts as a specific promoter, allosterically activating the polymerase's catalytic site. Thus, this thesis addresses two central phenomena within the context of replication: the coupling between the helicase and ATPase activities of NS3hel and the allosteric activation of the NS5 polymerase. Experimentally, several studies have shown that ATP hydrolysis is necessary for the helicase to move unidirectionally and to separate the double-stranded RNA, while the presence of RNA accelerates ATP hydrolysis. Using classical molecular dynamics simulations, the first step involved exploring the conformational space of the NS3hel-RNA complex and the possible changes upon different occupancy of the catalytic site. As a main result, the opening of the β6–β1’ loop was observed, forming a channel that facilitates the release of inorganic phosphate from the catalytic site. Another important result is the decreased affinity of NS3hel for RNA during the ATP hydrolysis cycle, which facilitates helicase translocation. The second step was to characterize the mechanism of the ATP hydrolysis reaction of NS3hel in the presence and absence of RNA. To this end, the free energy barriers of the rate-limiting step were compared using a hybrid quantum/classical description (QM/MM). The results of this study showed that catalysis occurs through a different mechanism and with lower activation energy in the presence of RNA. Finally, using a variant of classical molecular dynamics that involves the use of mixed solvent, conserved regions were identified in the four serotypes, both in the presence and absence of RNA, that could serve as druggable pockets. The other phenomenon addressed in this thesis is the promoter effect of SLA on the polymerase activity of NS5. Using classical molecular dynamics, the conformations of NS5 and how they are affected by the interaction with SLA were studied. Through further analysis based on graph theory and dynamic networks, the amino acids responsible for the information flow between the SLA binding site of NS5 and the catalytic site were identified. The results of this thesis provide relevant information for understanding at a molecular level the replication machinery of the Dengue virus and enable the design of new therapeutic strategies.

Citación:

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Sarto, Carolina. (2025). Estudios biofísicos de la maquinaria del virus del dengue : nuevas estrategias antivirales. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7780_Sarto

---------- CHICAGO ----------

Sarto, Carolina. "Estudios biofísicos de la maquinaria del virus del dengue : nuevas estrategias antivirales". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7780_Sarto

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