Contribución de las proteínas CRISP epididimarias a la fertilización y el desarrollo embrionario temprano

Sulzyk, Valeria

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Contribución de las proteínas CRISP epididimarias a la fertilización y el desarrollo embrionario temprano
Título alternativo:	Contribution of epididymal CRISP proteins to fertilization and early embryo development
Autor:	Sulzyk, Valeria
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	Fundación del Instituto de Biología y Medicina Experimental - CONICET. Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME)
Fecha de defensa:	2025-07-16
Fecha en portada:	30 de junio de 2025
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Departamento Docente:	Departamento de Química Biológica
Director:	Cuasnicú, Patricia Sara
Director Asistente:	Weigel Muñoz, Mariana
Consejero:	Fontana, Vanina Andrea
Jurado:	Franchi, Ana María; Cética, Pablo Daniel; Meroni, Silvina Beatriz
Idioma:	Español
Palabras clave:	FERTILIDAD; FERTILIZACION; ESPERMATOZOIDE; OVOCITO; EPIDIDIMO; CRISP; ANTICONCEPCION; DESARROLLO EMBRIONARIO; CALCIO; FRAGMENTACION DEL ADNFERTILITY; FERTILIZATION; SPERMATOZOON; OOCYTE; EPIDIDYMIS; CRISP PROTEINS; CONTRACEPTION; EMBRYO DEVELOPMENT; CALCIUM SIGNALLING; DNA FRAGMENTATION
Formato:	PDF
Handle:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7770_Sulzyk
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7770_Sulzyk.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7770_Sulzyk
Ubicación:	QUI 007770
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Sulzyk, Valeria. (2025). Contribución de las proteínas CRISP epididimarias a la fertilización y el desarrollo embrionario temprano. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7770_Sulzyk

Resumen:

Las proteínas de la familia Cysteine-Rich Secretory Proteins (CRISP1-4), con expresión mayoritaria en el tracto reproductor masculino de mamíferos, regulan canales de Ca2+, son claros mediadores del proceso de fertilización y resultan relevantes para la fertilidad de un individuo. En base a ello, en esta Tesis Doctoral nos propusimos explorar el posible empleo de las CRISP para el desarrollo de métodos de regulación de la fertilidad e investigar los mecanismos moleculares por los cuales las CRISP epididimarias son relevantes para la fertilidad a través de su contribución a la fertilización y posterior desarrollo embrionario. Teniendo en cuenta resultados previos de nuestro laboratorio en roedores y primates mostrando que la inmunización con la proteína CRISP1 induce la producción de anticuerpos específicos capaces de unirse a los espermatozoides, así como de inhibir la fertilidad sin producir efectos deletéreos, como primer objetivo nos propusimos identificar proteínas epididimarias CRISP en perros como posibles blancos anticonceptivos para el control de la creciente población canina callejera. Los resultados obtenidos revelaron la existencia de una proteína CRISP canina de expresión exclusivamente epididimaria, presente en los espermatozoides tanto epididimarios como eyaculados la cual no sólo permanece en los mismos luego de la capacitación, sino que se relocaliza al segmento ecuatorial, región involucrada en la fusión de gametas en todas especies estudiadas. Estas observaciones, junto al hecho de que la exposición de espermatozoides caninos a un anticuerpo capaz de reconocer a la proteína canina inhibiera significativamente la capacidad de los espermatozoides de penetrar el cúmulus de células que rodea al ovocito, apoya la participación de la proteína CRISP canina identificada en el proceso de fertilización y su futuro empleo como blanco para el desarrollo de un método anticonceptivo canino no hormonal. Dada la subfertilidad observada en las colonias de ratones doble KO para CRISP1 y CRISP4 (DKO 1/4) y para CRISP1 y CRISP3 (DKO 1/3) debidas a defectos exclusivos de fertilización y desarrollo embrionario, respectivamente, así como la infertilidad de las colonias carentes de más de dos proteínas simultáneamente, como segundo objetivo de esta Tesis nos propusimos generar y caracterizar una nueva colonia triple KO carente de CRISP1, CRISP3 y CRISP4 con el fin de analizar la relevancia de los diferentes miembros de la familia CRISP para la fertilidad. Los resultados indicaron que mientras la nueva colonia TKO mostró una mayor bajada en la fertilidad respecto a las colonias DKO 1/4 y 1/3, no alcanzó la infertilidad observada en la colonia TKO 1/2/3 previamente estudiada. El análisis del fenotipo reproductivo reveló la ausencia de defectos en la fertilización in vivo, a diferencia de lo observado en el modelo DKO 1/4, detectándose, en cambio, una bajada significativa en el desarrollo embrionario, tal como la observada para los animales DKO 1/3. A pesar de que todos los parámetros espermáticos estudiados resultaron normales, los espermatozoides TKO fueron prácticamente incapaces de fertilizar ovocitos in vitro, en concordancia con lo observado en todos los modelos carentes de CRISP4. En conjunto, esta caracterización permitió confirmar que la infertilidad no dependería exclusivamente de la cantidad sino de la combinación de proteínas delecionadas, contribuyendo a una mayor comprensión de los mecanismos de redundancia y compensación funcional entre los miembros de la familia CRISP. Como último objetivo de esta Tesis, nos propusimos investigar los mecanismos moleculares por los cuales las proteínas epididimarias CRISP1 y CRISP3 contribuyen al desarrollo embrionario temprano que afecta la fertilidad de todas las colonias carentes de estas proteínas. Los resultados obtenidos utilizando la colonia DKO 1/3, que solo exhibe defectos de desarrollo embrionario, indicaron que dichos defectos ya son acarreados por los espermatozoides epididimarios y no son debido a un retraso en la fertilización. Un hallazgo interesante fue que los ovocitos fertilizados in vitro por los espermatozoides mutantes mostraron un arresto en el reinicio de la meiosis no causado por alteración en las oscilaciones de Ca2+ durante la activación ovocitaria sino por niveles elevados de fragmentación del ADN espermático adquiridos durante el tránsito por el epidídimo. Nuestras observaciones también mostraron que la exposición de espermatozoides control a fluido epididimario de animales mutantes o a fluido control suplementado con Ca2+ incrementó significativamente la fragmentación del ADN y que los espermatozoides mutantes tanto frescos como capacitados exhibían niveles significativamente mayores de Ca2+ intracelular. En conjunto, estas observaciones nos permiten concluir que una desregulación en la homeostasis del Ca2+ durante la maduración epididimaria sería la responsable del daño en la integridad del ADN espermático que conduce al retraso en el reinicio de la meiosis y los consecuentes defectos en el desarrollo embrionario temprano, apoyando la relevancia de la maduración epididimaria más allá de la conocida adquisición de capacidad fertilizante. Consideramos que los resultados obtenidos en esta tesis utilizando como modelo a la familia de proteínas CRISP contribuirán a una mayor comprensión de la mecanismos moleculares involucrados en los procesos de fertilización y embriogénesis como así también al desarrollo de nuevos y mejores métodos tanto de regulación de la fertilidad como de diagnóstico y tratamiento de la fertilidad.

Abstract:

Cysteine-Rich Secretory Proteins (CRISP1–4), predominantly expressed in the male reproductive tract in mammals, regulate Ca2+ channels and act as key mediators of the fertilization process, playing critical roles in male fertility. Based on this, the aim of this PhD thesis was to explore the potential use of CRISP proteins for the development of fertility regulation methods, and to investigate the molecular mechanisms by which epididymal CRISP proteins contribute to fertility through their involvement in fertilization and subsequent embryo development. Based on previous results from our laboratory in rodents and primates showing that immunization with epididymal CRISP1 protein induces the production of specific antibodies capable of binding to sperm and inhibiting fertility without causing side effects, our first aim was to identify epididymal CRISP proteins in dogs as potential contraceptive targets for controlling the growing population of stray dogs. The results revealed the existence of a canine CRISP protein exclusively expressed in the epididymis and present in both epididymal and ejaculated sperm. Notably, this protein not only remains associated with sperm after capacitation but also relocates to the equatorial segment, a region involved in gamete fusion across all studied species. These observations, together with the finding that exposure of canine sperm to an antibody recognizing the canine CRISP protein significantly inhibited their ability to penetrate the cumulus cell layer surrounding the oocyte, support a role for this protein in fertilization and its potential use as a target for the development of a non-hormonal contraceptive method for dogs. Given the subfertility observed in double KO mouse colonies lacking CRISP1 and CRISP4 (DKO 1/4) or CRISP1 and CRISP3 (DKO 1/3), associated with fertilization and embryo development defects, respectively, as well as the infertility reported in colonies lacking more than two CRISP proteins simultaneously, the second aim of this Thesis was to generate and characterize a novel triple KO (TKO) mouse line deficient in CRISP1, CRISP3 and CRISP4 in order to assess the relevance of different CRISP family members to fertility. The results indicated that, while the newly generated TKO line exhibited a more pronounced fertility decrease compared to DKO 1/4 and 1/3 models, it did not reach the infertility observed in the TKO 1/2/3 model previously studied. Reproductive phenotype analysis revealed no in vivo fertilization defects, in contrast to what was observed in the DKO 1/4 model and a significant reduction in embryo development similar to that seen in DKO 1/3 animals. Despite normal values in all sperm parameters analyzed, TKO sperm were almost unable to fertilize oocytes in vitro, consistent with what has been observed in all models lacking CRISP4. Altogether, these results confirmed that infertility does not depend only on the number of deleted CRISP proteins, but rather on the specific combination of the members deleted, contributing to a deeper understanding of the redundancy and functional compensation mechanisms operating within the CRISP protein family. As the last aim of this Thesis, we investigated the molecular mechanisms through which the epididymal proteins CRISP1 and CRISP3 contribute to early embryo development, a process compromised in all mouse colonies lacking these two proteins. Results obtained using the DKO 1/3 model, which exhibits defects only at the level of embryo development, indicated that these defects are already present in epididymal sperm and are not due to delayed fertilization. An interesting finding was that oocytes fertilized in vitro by mutant sperm showed an arrest in meiotic resumption that was not caused by alterations in Ca2+ oscillations during oocyte activation, but rather by elevated levels of sperm DNA fragmentation acquired during the epididymal transit. Our observations also showed that exposing control sperm to epididymal fluid from mutant animals or to control fluid supplemented with Ca2+, significantly increased sperm DNA fragmentation, and that both fresh and capacitated mutant sperm exhibited significantly higher intracellular Ca2+ levels. Altogether, these findings indicate that a dysregulation of Ca2+ homeostasis during epididymal maturation may compromise the integrity of sperm DNA, resulting in delayed meiotic resumption and subsequent defects in early embryo development highlighting the importance of epididymal maturation beyond its established role in the acquisition of sperm fertilizing ability. We believe that the results obtained in this thesis using the CRISP protein family as a model will contribute to a deeper understanding of the molecular mechanisms involved in fertilization and embryogenesis, as well as to the development of methods for both fertility regulation and diagnosis, and treatment of infertility.

Citación:

---------- APA ----------

Sulzyk, Valeria. (2025). Contribución de las proteínas CRISP epididimarias a la fertilización y el desarrollo embrionario temprano. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7770_Sulzyk

---------- CHICAGO ----------

Sulzyk, Valeria. "Contribución de las proteínas CRISP epididimarias a la fertilización y el desarrollo embrionario temprano". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7770_Sulzyk

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