Efectos de la luz y la temperatura sobre el splicing alternativo de genes del reloj de las plantas : mecanismos e impacto funcional

Assaf, Constanza Helena

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Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Efectos de la luz y la temperatura sobre el splicing alternativo de genes del reloj de las plantas : mecanismos e impacto funcional
Título alternativo:	Effects of light and temperature on alternative splicing of plant clock genes : mechanisms and functional impact
Autor:	Assaf, Constanza Helena
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	Fundación Instituto Leloir - CONICET. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires (IIBBA)
Fecha de defensa:	2025-06-27
Fecha en portada:	2025
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Departamento Docente:	Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Director:	Yanovsky, Marcelo Javier
Consejero:	Cerdán, Pablo Diego
Jurado:	Muschietti, Jorge Prometeo; Auge, Gabriela Alejandra; Trupkin, Santiago Ariel
Idioma:	Español
Palabras clave:	ARABIDOPSIS; RELOJ CIRCADIANO; SPLICING ALTERNATIVO; RVE8; LNK1; LUZ; TEMPERATURA; ISOFORMASARABIDOPSIS; CIRCADIAN CLOCK; ALTERNATIVE SPLICING; RVE8; LNK1; LIGHT; TEMPERATURE; ISOFORMS
Formato:	PDF
Handle:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7758_Assaf
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7758_Assaf.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7758_Assaf
Ubicación:	BIO 007758
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Assaf, Constanza Helena. (2025). Efectos de la luz y la temperatura sobre el splicing alternativo de genes del reloj de las plantas : mecanismos e impacto funcional. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7758_Assaf

Resumen:

Muchos procesos moleculares y fisiológicos en las plantas ocurren en momentos específicos del día. Estos ritmos diarios son generados por el reloj circadiano, un mecanismo endógeno que utiliza la duración del día y la temperatura para sincronizar el tiempo interno de distintos eventos fisiológicos y de desarrollo con los cambios en el ambiente. En Arabidopsis, el reloj está compuesto por múltiples circuitos de retroalimentación transcripcionales. Entre ellos se destaca uno, en donde el factor de transcripción REVEILLE 8 (RVE8) interactúa con los co-activadores transcripcionales NIGHT LIGHT INDUCIBLE AND CLOCK REGULATED 1 (LNK1) y LNK2 para promover la expresión de genes vespertinos del reloj y otros genes clave, como los que codifican factores de tolerancia al frío. Existe fuerte evidencia de una regulación adicional mediada por mecanismos co- y post-transcripcionales en el control circadiano. En particular, la mayoría de los genes centrales del reloj de las plantas sufren splicing alternativo (SA), mecanismo por el cual un gen puede dar lugar a varios transcriptos. Este ajuste del transcriptoma es particularmente prevalente en respuesta a estrés y cambios ambientales. En este trabajo, se validaron y caracterizaron eventos de SA dependientes de la luz y la temperatura en los genes RVE8 y LNK1 del reloj circadiano. Utilizando secuenciación masiva de RNA de alto rendimiento (RNA-seq), evaluamos el efecto de un pulso de luz roja en la mitad de la noche en plantas wild type (WT) y mutantes quíntuples de fitocromos (phyQ). Encontramos que el SA de 483 genes se vió afectado por el tratamiento, siendo menor el efecto de los fitocromos que el efecto de la luz, lo cual resalta la importancia de mecanismos independientes de fitocromos en el control del SA mediado por luz. Además, observamos que genes del reloj, tales como RVE8 y LNK1 mostraban cambios en sus patrones de SA en respuesta al tratamiento lumínico, sugiriendo que la regulación del SA por luz podría jugar un papel en el entrenamiento del reloj. Paralelamente, se ha demostrado mediante Secuenciación de Nueva Generación (NGS) que, en plantas WT, las bajas temperaturas promueven la acumulación de ciertas variantes de SA de RVE8 y LNK1, que dan origen a proteínas truncadas. Con el fin de ampliar la comprensión de la relevancia biológica de las isoformas de SA de dichos genes, generamos líneas transgénicas expresando las distintas variantes de splicing en un fondo mutante. Se encontró que tanto la isoforma canónica (FL) como la isoforma alternativa (AS) de RVE8, rescatan parcialmente el fenotipo de una triple mutante rve en distintas funciones asociadas al reloj. A su vez, se observó una respuesta diferencial en el control de la fotomorgénesis entre las líneas sobreexpresantes de RVE8-FL y RVE8-AS bajo diferentes condiciones ambientales. Un análisis de los patrones de acumulación de ambas versiones de RVE8, revelo que la isoforma alternativa exhibe un retraso en el pico de expresión, y, en condiciones de estrés por frío, se acumula y mantiene sus niveles constantes a lo largo del día. Al observar la localización subcelular de ambas proteínas, detectamos una tendencia de RVE8-FL a acumularse en el núcleo tras la exposición a bajas temperaturas. Además, los genes diana de RVE8 mostraron una mayor inducción de la expresión en las primeras horas de exposición al frío en las líneas expresando RVE8-FL bajo su propio promotor. Finalmente, por medio del modelado predictivo de las isoformas de SA de RVE8 y LNK1, demostramos que los dominios C y N-terminal de ambas proteínas, respectivamente, se encuentran estructuralmente afectados. Aun así, mediante un análisis de doble hibrido se evidenció que la isoforma alternativa de RVE8 conserva la capacidad de interacción. Estos resultados sugieren que el splicing alternativo de genes centrales del reloj daría lugar a proteínas con funciones parcialmente distintas a sus contrapartes canónicas, las cuales podrían tener un rol en mediar un ajuste fino de las respuestas biológicas a cambios ambientales.

Abstract:

Many molecular and physiological processes in plants occur at specific times of day. These daily rhythms are generated by the circadian clock, an endogenous timekeeper that uses day length and temperature to synchronize the internal timing of several physiological and developmental events with changes in the environment. In Arabidopsis, the clock is composed of multiple transcriptional feedback loops, in which the circadian MYB transcription factor REVEILLE 8 (RVE8) interacts with the transcriptional co-activators NIGHT LIGHT INDUCIBLE AND CLOCK REGULATED 1 (LNK1) and LNK2 to promote the expression of evening-phased clock genes and cold tolerance factors. There is strong evidence of additional regulation by co- and post-transcriptional mechanisms in circadian control. Particularly, most plant core clock genes undergo alternative splicing (AS), a mechanism by which a single gene can give rise to several transcripts. This transcriptome adjustment is particularly prevalent in response to stress and environmental changes. In this work, light and temperature-dependent AS events of RVE8 and LNK1 clock genes were validated and characterized. Using high-throughput RNA sequencing (RNA-seq), we evaluated the effect of a red light pulse given in the middle of the night in wild type (WT) and phytochrome quintuple mutant (phyQ) plants. We found that the treatment affected AS events corresponding to 483 genes, the effect of phytochromes being much smaller than the effect of light. These results highlight the importance of phytochrome-independent mechanisms in light-mediated AS control. Furthermore, we observed that core-clock genes such as RVE8 and LNK1 showed changes in their AS patterns in response to the light treatment, suggesting that light regulation of AS might play a role in clock entrainment. It has also been shown through Next Generation Sequencing (NGS) that, in WT plants, low temperatures promote the accumulation of alternatively spliced variants of RVE8 and LNK1, which encode truncated proteins. In order to broaden the understanding of the biological relevance of the AS isoforms of these genes, we generated transgenic lines carrying different splicing variants in a mutant background. We found that both canonical (FL) and alternative (AS) RVE8 isoforms, partially rescue rve triple mutant phenotype in different clock associated responses. In addition, a differential behavior was observed in the control of photomorphogenic responses between the lines overexpressing RVE8-FL y RVE8-AS under several environmental conditions. Accumulation patterns analysis of both versions of RVE8, revealed that the alternative isoform exhibits a delayed expression peak and, under cold stress conditions, accumulates and maintains constant levels throughout the day, losing rhythmicity. Upon examining the subcellular localization of both proteins, we observed a tendency for RVE8-FL to accumulate in the nucleus after exposure to low temperatures. Additionally, the target genes of RVE8 showed higher levels of expression in the first few hours of cold treatment, in the lines expressing RVE8-FL under its native promoter. Finally, through predictive modeling of the AS isoforms of RVE8 and LNK1, we showed that the C and N-terminal domains of both proteins, respectively, are structurally altered. Nevertheless, a yeast two-hybrid analysis confirmed that the alternative isoform of RVE8 its still able to interact. These results suggest that alternative splicing of core clock genes may give rise to protein isoforms with partially distinct functions compared to their canonical counterparts, which could play a role in fine-tuning biological responses to environmental changes.

Citación:

---------- APA ----------

Assaf, Constanza Helena. (2025). Efectos de la luz y la temperatura sobre el splicing alternativo de genes del reloj de las plantas : mecanismos e impacto funcional. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7758_Assaf

---------- CHICAGO ----------

Assaf, Constanza Helena. "Efectos de la luz y la temperatura sobre el splicing alternativo de genes del reloj de las plantas : mecanismos e impacto funcional". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7758_Assaf

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