Utilización de células madre tumorales derivadas de pacientes para identificar posibles blancos terapéuticos que determinen la capacidad invasiva de gliomas de alto grado

Morris Hanon, Olivia

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Utilización de células madre tumorales derivadas de pacientes para identificar posibles blancos terapéuticos que determinen la capacidad invasiva de gliomas de alto grado
Título alternativo:	Use of patient-derived tumor stem cells to identify potential therapeutic targets that determine the invasive capacity of high-grade gliomas
Autor:	Morris Hanon, Olivia
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	CONICET - FLENI - Instituto de Neurociencias (INEU)
Fecha de defensa:	2024-10-14
Fecha en portada:	2024
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Departamento Docente:	Departamento de Química Biológica
Director:	Videla Richardson, Guillermo Agustín
Director Asistente:	Rojas, Paola A.
Consejero:	Vázquez, Elba Susana
Jurado:	Cotignola, Javier Hernán; Mariño, Karina Valeria; Jancic, Carolina Cristina
Idioma:	Español
Palabras clave:	GLIOBLASTOMA; CELULAS MADRE TUMORALES; MIGRACION; INVASION; TRANSCRIPTOMICAGLIOBLASTOMA; CANCER STEM CELLS; MIGRATION; INVASION; TRANSCRIPTOMICS; HYPOXIA
Formato:	PDF
Handle:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7667_MorrisHanon
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7667_MorrisHanon.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7667_MorrisHanon
Ubicación:	QUI 007667
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Morris Hanon, Olivia. (2024). Utilización de células madre tumorales derivadas de pacientes para identificar posibles blancos terapéuticos que determinen la capacidad invasiva de gliomas de alto grado. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7667_MorrisHanon

Resumen:

El glioblastoma (GBM) es el tumor primario maligno más común y letal del sistema nervioso central y, a pesar de décadas de investigación, el pronóstico de los pacientes con GBM no ha mejorado sustancialmente. La dificultad para desarrollar tratamientos más efectivos se adjudica, en parte, a la presencia de células madre tumorales (CMT). Estas células son capaces de resistir a las terapias antineoplásicas, pudiendo regenerar el tumor luego de su resección. El carácter difuso de los GBM es otro factor que dificulta el desarrollo de terapias efectivas. Estos tumores no tienen bordes histológicamente claros y definidos. En la periferia, las células tumorales se encuentran invadiendo el parénquima cerebral normal. Esta habilidad para invadir imposibilita la resección total del tumor mediante cirugía y conlleva la generación de nuevos focos tumorales. A pesar del rol central de la migración e invasión celular en la progresión y la recurrencia del GBM, no se han desarrollado tratamientos que tengan como blanco estos procesos. Más aún, algunos tratamientos incluso son capaces de aumentar la capacidad invasiva de estas neoplasias. Teniendo en cuenta estas consideraciones, se propuso como objetivo general de esta tesis estudiar la capacidad migratoria e invasiva de las CMG. Para ello, dada la heterogeneidad inter-tumoral que presentan los GBM, se utilizaron varias líneas de CMG derivadas de pacientes con el fin de identificar posibles blancos terapéuticos que afecten estos procesos biológicos. A lo largo de este trabajo se evaluó la capacidad migratoria e invasiva de las líneas de CMG, tanto en condiciones basales de cultivo (normoxia), como en respuesta a hipoxia (1% O2 durante 72 horas), ya que la hipoxia es un inductor conocido de la migración e invasión en GBM. Los ensayos de migración in vitro revelaron una elevada variabilidad entre las distintas líneas de CMG. Se observó que algunas de ellas exhiben una capacidad migratoria de hasta cinco veces mayor que la de otras. Además, encontramos que, en respuesta a hipoxia, cinco de las ocho líneas analizadas aumentan su capacidad migratoria, una no se ve afectada y, llamativamente, otras dos la disminuyen. Respecto a la capacidad de invasión, no se observó una relación directa entre la invasión y la migración. Por ejemplo, una línea de CMG presentó la menor capacidad migratoria, pero a su vez, exhibió la mayor capacidad invasiva. Con el fin de comprender la variabilidad en la migración/invasión entre las líneas tumorales, se realizó una secuenciación masiva del transcriptoma, tanto en normoxia como en hipoxia en cuatro líneas de CMG. La secuenciación permitió analizar la heterogeneidad entre estas líneas en cuanto a la expresión diferencial de genes y el enriquecimiento de conjuntos de genes asociados a procesos biológicos o a factores de transcripción. Con estos análisis se confeccionó un listado con numerosos posibles blancos terapéuticos. De esta selección inicial de genes, se priorizaron aquellos que mostraron una elevada expresión y una baja variabilidad entre réplicas. De acuerdo con estos criterios, se eligieron seis genes candidatos para ser evaluados en profundidad: HIF1α, HIF2α, fibronectina 1 (FN1), condroitínsulfato proteoglicano 5 (CSPG5), y las galectinas 1 y 3 (LGAS1 y LGALS3). Para evaluar la relevancia de HIF1α y HIF2α en la capacidad migratoria e invasiva de CMG, llevamos a cabo los silenciamientos génicos de los mismos utilizando ARN pequeños de interferencia (siRNA) y, posteriormente, realizamos ensayos de migración e invasión in vitro. En todas las líneas de CMG pudimos observar que HIF1α y/o HIF2α afectan la migración. Sorprendentemente, en algunas líneas de CMG el silenciamiento de estos factores de transcripción condujo a la inhibición de la migración, mientras que, en otras, a un incremento de esta. De manera similar, el silenciamiento de CSPG5 también genero efectos variables entre las líneas de CMG, ya que su silenciamiento llevo a un aumento de la migración sólo en dos de las líneas de CMG estudiadas. Al silenciar FN1 se observó que su silenciamiento llevaba a un aumento de la migración en dos líneas. El rol de FN1 en la migración también se evaluó agregando concentraciones definidas de esta proteína a los componentes de la matriz extracelular empleada como sustrato en los ensayos migratorios. Pudimos observar que bajas concentraciones de fibronectina recombinante aumentan la migración de las CMG, mientras que concentraciones mayores la inhiben. Cabe resaltar que este efecto dual se observó en todas las líneas de CMG. El efecto del silenciamiento de LGALS1 sobre la migración fue homogéneo en todas las líneas de CMG ensayadas, la disminución de su expresión conllevó una menor capacidad migratoria. El silenciamiento de LGALS3, en cambio, disminuyó la migración en todas las líneas exceptuando una. Por último, se evaluó si las líneas de CMG que exhibieron una baja capacidad migratoria en normoxia e hipoxia, son capaces de aumentar su migración frente a otros estímulos. Para ello, se evaluó el efecto de medios condicionados en la capacidad migratoria de las líneas CMG. En particular, se evaluaron dos tipos de medios condicionados medio condicionado por macrófagos y medio condicionado por la misma línea de CMG. Se observó que una de las líneas de CMG con baja migración basal cuya capacidad migratoria e invasora disminuye con la hipoxia, aumenta notablemente su migración con medios condicionados. Este resultado evidencia que la baja migración de esta línea, no se debe a una inhabilidad para migrar sino a la falta de estímulos externos precisos. En conclusión, en esta tesis se lograron identificar numerosos genes que podrían representar posibles blancos terapéuticos para interferir en la invasión del GBM, en particular, la invasión en respuesta a la hipoxia. Sin embargo, los resultados obtenidos resultaron muy variables entre las líneas celulares estudiadas, recalcando la importancia de considerar la heterogeneidad inter-tumoral a la hora de desarrollar terapias.

Abstract:

Glioblastoma (GBM) is the most common and lethal primary malignant tumor of the central nervous system. Despite decades of research, the prognosis of patients with GBM has not substantially improved. The difficulty in developing more effective treatments is attributed, in part, to the presence of tumor stem cells (TSC). These cells can resist antineoplastic therapies and can regenerate the tumor after its resection. The diffuse nature of GBM is another factor that hinders the development of effective therapies. These tumors do not have clear and defined histological borders. In the periphery of the tumor, tumor cells are found invading the normal brain parenchyma. This ability to invade makes total resection of the tumor by surgery impossible and leads to the generation of new tumor foci. Despite the central role of cell migration and invasion in GBM progression and recurrence, no treatments have been developed that target these processes. Furthermore, many treatments can increase the invasive capacity of these tumors. Taking these considerations into account, the general objective of this thesis was to study the migratory and invasive capacity of GSCs. To this end, given the inter-tumor heterogeneity that GBM presents, several GSC lines derived from patients were used to identify possible therapeutic targets that affect these biological processes. Throughout this work, the migratory and invasive capacity of the GSC lines was evaluated, both under basal culture conditions (normoxia) and in response to hypoxia (1% O2 for 72 hours) as hypoxia is a known inducer of migration in GBM. In vitro migration assays revealed a high variability between the different GSC lines. Some cell lines exhibit a migratory capacity up to five times greater than that of others. Furthermore, we found that, in response to hypoxia, five of the eight lines analyzed increase their migratory capacity, one cell line is not affected and, strikingly, two others show decreased migration. Regarding the invasion capacity, it was not possible to establish a direct relationship between invasion and migration. For example, a GSC line exhibited the lowest migratory capacity, and exhibited the highest invasive capacity. To understand the variability observed in migration/invasion between tumor lines, high- throughput transcriptome sequencing was performed, both in normoxia and hypoxia in four GSClines. Sequencing allowed us to analyze the heterogeneity between these lines in terms of the differential expression of genes and the participation of pathways associated to biological processes as well as transcription factors. With this analysis on the pathways, transcription factors and genes differentially expressed a list was made with numerous possible therapeutic targets. From this initial selection of genes, those that showed high expression and low variability between replicates were prioritized. According to these criteria, four candidate genes were chosen to be further evaluated: HIF1α, HIF2α, fibronectin 1 (FN1), and chondroitin sulfate proteoglycan 5 (CSPG5). To evaluate the relevance of HIF1α and HIF2α in the migratory and invasive capacity of CMG, we carried out gene silencing of them using small interfering RNA (siRNA) and subsequently performed in vitro migration and invasion assays. In all CMG lines we could observe that HIF1α and/or HIF2α affect migration. Surprisingly, in some CMG lines the silencing of these transcription factors led to the inhibition of migration, while in others, to an increase in it. Similarly, silencing of CSPG5 also generated variable effects between CMG lines, since its silencing led to an increase in migration in only two of the CMG lines studied. The role of FN1 in migration was evaluated by adding defined concentrations of this protein to the components of the extracellular matrix used as substrate in the migratory assays. We were able to observe that low concentrations of recombinant fibronectin increase GSC migration, while higher concentrations inhibit it. It should be noted that this dual effect was observed in all CMG lines. The effect of LGALS1 silencing on migration was homogeneous in all the CMG lines tested; the decrease in its expression led to a lower migratory capacity. Silencing of LGALS3, on the other hand, decreased migration in all lines except one. Finally, we evaluated whether CMG lines that exhibited a low migratory capacity in normoxia and hypoxia can increase their migration in the face of other stimuli. To this end, the effect of conditioned media on the migratory capacity of CMG lines was evaluated. Two types of conditioned media were evaluated: medium conditioned by macrophages and medium conditioned by the same CMG line. It was observed that one of the CMG lines with low basal migration whose migratory and invasive capacity decreases with hypoxia, notably increases its migration with conditioned media. This result shows that the low migration of this line is not due to an inability to migrate but to the lack of precise external stimuli. In conclusion, in this thesis we were able to identify numerous genes and signaling pathways that could represent possible therapeutic targets to interfere with GBM invasion, in particular, invasion in response to hypoxia. However, the results obtained were very variable between the cell lines studied, emphasizing the importance of considering inter-tumor heterogeneity when developing therapies, within the framework of precision medicine.

Citación:

---------- APA ----------

Morris Hanon, Olivia. (2024). Utilización de células madre tumorales derivadas de pacientes para identificar posibles blancos terapéuticos que determinen la capacidad invasiva de gliomas de alto grado. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7667_MorrisHanon

---------- CHICAGO ----------

Morris Hanon, Olivia. "Utilización de células madre tumorales derivadas de pacientes para identificar posibles blancos terapéuticos que determinen la capacidad invasiva de gliomas de alto grado". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7667_MorrisHanon

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