Análisis de factores determinantes para el desarrollo de lesiones premalignas en la mucosa oral y anal : rol de las oncoproteínas E6/E7 del virus del papiloma humano (VPH)

Ayre, Marina

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Análisis de factores determinantes para el desarrollo de lesiones premalignas en la mucosa oral y anal : rol de las oncoproteínas E6/E7 del virus del papiloma humano (VPH)
Título alternativo:	Analysis of determining factors for the development of premalignant lesions in the oral and anal mucosa : role of the human papillomavirus (HPV) E6/E7 oncoproteins
Autor:	Ayre, Marina
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias (IFIBYNE)
Fecha de defensa:	2024-11-29
Fecha en portada:	29 de noviembre de 2024
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Departamento Docente:	Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Director:	Raimondi, Ana Rosa
Consejero:	Srebrow, Anabella
Jurado:	Lamb, Caroline A.; Carcagno, Abel Luis; Eiján, Ana María
Idioma:	Español
Formato:	PDF
Handle:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7663_Ayre
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7663_Ayre.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7663_Ayre
Ubicación:	BIO 007663
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Ayre, Marina. (2024). Análisis de factores determinantes para el desarrollo de lesiones premalignas en la mucosa oral y anal : rol de las oncoproteínas E6/E7 del virus del papiloma humano (VPH). (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7663_Ayre

Resumen:

La infección con subtipos de alto riesgo del VPH (virus del papiloma humano), mayormente VPH-16, se asocian con el desarrollo de carcinoma de células escamosas (CCE) de cérvix, ano, vulva, pene y cabeza y cuello. Los CCE se producen en epitelios estratificados como los de la cavidad oral, faringe, laringe (denominados en su conjunto como carcinomas de cabeza y cuello), cérvix y el resto de las mucosas del tracto gastrointestinal. Los CCE difieren de acuerdo al órgano donde se desarrollan, en su frecuencia, y pronóstico, pero algunos de ellos comparten los factores etiológicos. En las últimas décadas, ha aumentado la incidencia de CCE de cabeza y cuello (CCECC), en particular los orofaríngeos, así como los CCE anales (CCEA) vinculados al VPH. Hasta el momento, no se conocen con precisión los mecanismos moleculares específicos que participan en la patogénesis del CCEA y los CCECC positivos para VPH, ni las razones detrás de su desarrollo en esas localizaciones anatómicas específicas. El papel del VPH en la aparición de lesiones premalignas y cánceres del tracto genital femenino ha sido objeto de numerosos estudios, a diferencia de lo que ocurre con los CCEA y CCECC. A pesar de todo el conocimiento establecido sobre el mecanismo de acción viral, no se sabe con certeza si la expresión de las oncoproteinas virales E6 y E7 es suficiente para iniciar el proceso carcinogénico en la mucosa anal y oral. En este sentido, la ausencia de modelos in vivo apropiados para estudiar cómo la expresión de las proteínas virales afecta los tejidos involucrados representa un obstáculo significativo. Por lo tanto, estudiar el impacto de la expresión de las oncoproteinas virales mencionadas en el canal anal y la cavidad bucal aportarían datos de gran interés en el entendimiento del desarrollo de estos cánceres. Basados en el conocimiento previo de la acción viral en otros tejidos nuestra hipótesis fue la siguiente: la expresión de las proteínas E6 y E7 del VPH-16 en el estrato basal del epitelio anal y bucal altera la homeostasia de los mismos, facilitando la transformación celular y posterior progresión maligna al acumular alteraciones genómicas adicionales. Al respecto, con el fin de estudiar el rol de las proteínas virales E6 y E7 en la carcinogénesis anal y oral en este trabajo se desarrollaron ratones transgénicos para expresar E6/E7 del VPH-16 de manera tejido específica (K14CreER TAM /Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-rtTA flox / Tet-E6/E7: TG-E6/E7). En el modelo TG-E6/E7, la expresión de E6/E7 se logra, de manera dependiente de la Cre recombinasa, después de la administración de tamoxifeno (TAM) seguido de administración de doxiciclina (DOX). Se caracterizó la expresión tejido específica utilizando dos sistemas reporteros: Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-rtTA flox y Rosa26tdTomato, confirmándose así la expresión en los tejidos que se iban a analizar. Los animales TG-E6/E7 se dividieron en grupos según el tiempo de administración de DOX: 2 meses (grupo A), 4 meses (grupo B) y 5-6 meses (grupo C) y 2 meses con DOX + 2 meses sin DOX (grupo D) además de un grupo de animales con TAM sin DOX (grupo control). Los grupos A, B C y D no presentaron ningún fenotipo evidente y no tuvieron diferencias significativas en el tiempo de supervivencia respecto al grupo control. A nivel del canal anal, el grupo control no presentó cambios histológicos relevantes; sin embargo, el grupo A presentó irregularidades morfológicas a nivel celular y tisular, diagnosticándose hiperplasia epitelial con hiperqueratosis, llegando a desarrollarse displasias (3/7). La evaluación histológica de los grupos B y C reveló nuevamente un epitelio anal anormal, con alteraciones similares a las descriptas en el epitelio anal TG-E6/E7 del grupo A. Se diagnosticaron hiperplasias y displasias, llegando a encontrar un caso de displasia severa. Las alteraciones anales provenientes de animales TG-E6/E7 expresaban CK14 mientras que fueron negativas para CK7, confirmándose el origen escamoso de las mismas. En cuanto a la mucosa lingual TG-E6/E7 la evaluación histológica también reveló irregularidades celulares y tisulares luego de dos meses. Pero a diferencia de la mucosa anal, la lengua TG presentaba escasas zonas de hiperplasia y gran cantidad de áreas con diagnóstico de displasia (7/11). Las displasias descriptas variaban en severidad desde leves hasta severas. Todos los cambios histológicos mencionados no se observaron en el grupo control. Después de 4 meses de expresión de E6/E7, la lengua transgénica desarrolló cambios displásicos en todos los casos estudiados y esos cuadros no evolucionaron aún después de 6 meses de seguimiento. Las lenguas TG-E6/E7 presentaron expresión de CK14 y la misma estaba aumentada y desregulada en las áreas displásicas. Tanto para la mucosa anal como lingual TG se constató la expresión de E6. Con el grupo D se comprobó que el fenotipo proliferativo era dependiente de la expresión de E6/E7, dado que no se observó la evolución del fenotipo hiperplásico ni de la marcación de BrdU. Concluyendo que la mucosa anal y el epitelio lingual son susceptibles a la expresión de las oncoproteínas E6 y E7 dado que desencadenan el desarrollo de lesiones premalignas. Dado que la activación de mTOR es una característica común de los CCEA y CCE bucales, se estudió la expresión de S6 fosforilado, el blanco más extremo río abajo de la vía de señalización celular PI3K/mTOR. Se analizó la expresión de pS6 en el epitelio anal y lingual transgénico en comparación con los animales control. La mucosa anal y las lenguas de los animales TG-E6/E7 mostraron un aumento notable en la expresión de pS6 en comparación con el grupo control. Además, y con el fin de validar el modelo murino, se evaluó preliminarmente la expresión de pS6 en biopsias anales de lesiones premalignas humanas (AIN) positivas para distintos subtipos de VPH. Se encontró que todos los casos VPH positivos expresaban pS6. En cuanto a los CCECC humanos se utilizó la base de datos del TCGA, encontrando evidencia preliminar de activación aberrante de la vía de señal PI3K en muestras de carcinomas de lengua VPH positivos (lengua móvil y base de la lengua). En el contexto de la presente tesis doctoral, el análisis preliminar sobre la vía PI3K/mTOR, en biopsias de lesiones premalignas anales así como del TCGA para CCECC, da soporte y relevancia al fenotipo descripto en el canal anal y la lengua TG-E6/E7 con expresión de pS6. A la vez, esos resultados sirvieron de antecedente para el desarrollo del siguiente objetivo. Con la finalidad de entender mejor el posible rol de la vía de señalización celular PI3K/mTOR en la iniciación y/o progresión de la carcinogénesis de los epitelios escamosos en estudio se utilizó una línea murina condicional “knock in” con una mutación activante frecuentemente reportada en la fostadilinositol-3-quinasa (PIK3C). Se generaron animales dobles transgénicos (K14CreER TAM /Pik3ca H1047R : K14/PI3K). Se constató la activación de PI3K y se estudió el fenotipo de los animales K14/PI3K hasta 4 meses de evolución. El análisis morfológico del canal anal K14/PI3K reveló alteraciones histológicas como hiperplasia con hiperqueratosis, llegando a diagnosticarse displasias leves en todos los casos. Respecto al epitelio de la lengua, este presentaba hiperqueratosis con ligeras irregularidades celulares y cambios epiteliales compatibles con displasia leve o moderada. Los resultados obtenidos demuestran que la expresión de PI3KC activada en el epitelio anal y lingual es suficiente para producir displasias en esos tejidos y sugieren que la activación de la vía de mTOR cumple un rol en el desarrollo de las lesiones premalignas. Teniendo en cuenta los resultados mencionados, y habiendo establecido un sistema genéticamente definido para estudiar la expresión de E6 y E7 en la mucosa anal y lingual, el tercer objetivo consistió en evaluar la interacción de la expresión de PI3KC activada o K-ras activado en el epitelio anal y bucal junto a la expresión de E6 y E7 in vivo. Se generaron nuevos animales K14CreER TAM /Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-rtTA flox /Tet-E6/E7/Pik3ca H1047R (ratones compuestos I). Se realizó un seguimiento de hasta 4 meses. Los animales compuestos desarrollaron alteraciones en la mucosa anal y lingual, las mismas no superaron en gravedad a las descriptas en el modelo TG-E6/E7. El desarrollo de las displasias fue diferente entre el canal anal y la lengua, llegándose a observar cambios morfológicos de manera más temprana y en algunos casos con cambios displásicos severos solo para el epitelio lingual. La mucosa anal de estos animales presentó una expresión aumentada de pS6 mientras que la marcación en la lengua fue parcheada dependiente de las lesiones desarrolladas. Por lo tanto hasta aquí no hemos encontrado evidencia de un efecto cooperativo o sinérgico entre la expresión de E6/E7 y la activación de PI3K en la mucosa anal y bucal en nuestro modelo animal. En relación a la carcinogénesis de la mucosa anal, además, se generaron animales K14-CreER TAM /LSL-K-ras G12D/+ . Los mismos habían sido caracterizados previamente en nuestro laboratorio solamente por su fenotipo bucal. Aquí se estudiaron las lesiones anales, encontrado que presentaban displasias de bajo grado, un patrón de expresión anómalo para CK14, así como un aumento en la expresión de pS6 en las capas superiores del epitelio TG. Aportando, de esta manera, más evidencia en cuanto a la participación de la vía de mTOR, en el contexto de la señalización Ras/Akt/mTOR, en la carcinogénesis anal según nuestro sistema in vivo. En el futuro se evaluará la posible sinergia con E6/E7. En su conjunto los resultados de esta tesis demuestran la participación de las proteínas E6 y E7 del VPH-16 en el proceso de carcinogénesis temprana de la mucosa anal y nuevos elementos para discutir su rol en localizaciones específicas de la región de cabeza y cuello. El sistema murino aquí desarrollado y caracterizado es especialmente importante, ya que no existen otros modelos in vivo que permitan investigar el proceso de carcinogénesis vinculado a la infección por VPH en los tejidos analizados. Asimismo, el incremento en pS6 registrado en las lesiones experimentales y las humanas respalda la necesidad de realizar un análisis más exhaustivo en el futuro, con el fin de entender mejor el posible rol de la vía PI3K/AKT/mTOR en el desarrollo de estas lesiones premalignas inducidas por E6/E7, así como su posible efecto diferencial entre la cavidad bucal y el canal anal. Pudiendo aportar así nuevos datos a las diferencias epidemiológicas observadas en los tejidos humanos, donde se describe la prevalencia de VPH-16 tanto en la lengua como en canal anal pero resultando oncogénica solo en la mucosa anal.

Abstract:

Infection with high-risk subtypes of HPV (human papillomavirus), primarily HPV-16, is associated with the development of squamous cell carcinoma (SCC) of the cervix, anus, vulva, penis, and head and neck. SCCs arise in stratified epithelia such as those in the oral cavity, pharynx, larynx (collectively referred to as head and neck carcinomas), cervix, and other mucosal surfaces of the gastrointestinal tract. SCCs vary in frequency and prognosis depending on the organ where they develop, although some share etiological factors. In recent decades, there has been an increase in the incidence of head and neck SCC (HNSCC), particularly oropharyngeal SCC, as well as anal SCC (ASCC), both related to HPV infection. To date, the specific molecular mechanisms involved in the pathogenesis of HPV-positive ASCC and HNSCC, and the reasons behind their development in these particular anatomical sites, remain unclear. The role of HPV in the onset of premalignant lesions and cancers of the female genital tract has been extensively studied, unlike ASCC and HNSCC. Despite the established knowledge of viral mechanisms of action, it is still uncertain whether the expression of the viral oncoproteins E6 and E7 is sufficient to initiate the carcinogenic process in the anal and oral mucosa. In this regard, the absence of appropriate in vivo models to study how the expression of viral proteins affects the tissues involved represents a significant challenge. Therefore, studying the impact of the expression of these viral oncoproteins in the anal canal and oral cavity would provide valuable data for understanding the development of these cancers. Based on previous knowledge of viral action in other tissues, our hypothesis was that the expression of HPV-16 E6 and E7 proteins in the basal layer of the anal and oral epithelium disrupts their homeostasis, facilitating cellular transformation and subsequent malignant progression through the accumulation of additional genomic alterations. In this study, to investigate the role of E6 and E7 viral proteins in anal and oral carcinogenesis, we developed transgenic mice that express HPV-16 E6/E7 in a tissue-specific manner (K14CreER TAM / Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-rtTA flox / Tet-E6/E7: TG-E6/E7). In the TG-E6/E7 model, the expression of E6/E7 is achieved in a Cre recombinase dependent manner following tamoxifen (TAM) and doxycycline (DOX) administration. Tissue specific expression was characterized using two reporter systems, Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-rtTA flox and Rosa26-tdTomato. TG-E6/E7 animals were divided into groups based on the extent of DOX administration: 2 months (Group A), 4 months (Group B), 5-6 months (Group C), and 2 months with DOX + 2 months without DOX (Group D), along with a group of animals with TAM but no DOX (control group). Groups A, B, C, and D did not exhibit any overt phenotype and showed no significant differences in survival compared to the control group. At the anal canal level, the control group did not present relevant histological changes; however, Group A exhibited morphological irregularities at the cellular and tissue levels, with epithelial hyperplasia and hyperkeratosis, and some cases progressed to dysplasia (3/7). Histological evaluation of Groups B and C again revealed abnormal anal epithelium, with similar alterations to those described in the TG-E6/E7 anal epithelium of Group A. Hyperplasias and dysplasias were diagnosed, with one case of severe dysplasia. Anal alterations in TG-E6/E7 animals expressed CK14 but were negative for CK7, confirming their squamous origin. Regarding the TG-E6/E7 lingual mucosa, histological evaluation also revealed cellular and tissue irregularities after two months. However, unlike the anal mucosa, the TG tongue exhibited few hyperplastic areas but numerous dysplastic regions (7/11). The dysplasias ranged in severity from mild to severe. None of the aforementioned histological changes were observed in the control group. After 4 months of E6/E7 expression, the transgenic tongue developed dysplastic changes in all cases studied, and these lesions did not progress even after 6 months of follow-up. TG-E6/E7 tongues exhibited increased and deregulated CK14 expression in dysplastic areas. Both the anal and lingual TG mucosa showed E6 expression. In Group D, it was confirmed that the proliferative phenotype was dependent on E6/E7 expression, as the hyperplastic phenotype and BrdU labeling did not evolve. This suggests that the anal mucosa and lingual epithelium are susceptible to E6 and E7 expression, triggering the development of premalignant lesions. Given that mTOR activation is a common feature of ASCC and oral SCC, we examined phosphorylated S6 expression, the most downstream target of the PI3K/mTOR signaling pathway. pS6 expression was analyzed in TG anal and lingual epithelium compared to control animals. The anal mucosa and tongues of TG-E6/E7 animals showed a notable increase in pS6 expression compared to the control group. Additionally, to validate the mouse model, we preliminarily evaluated pS6 expression in human anal biopsy samples from HPV-positive premalignant lesions (AIN). All HPV-positive cases expressed pS6. Regarding human HNSCC, we used data from TCGA, finding preliminary evidence of aberrant PI3K signaling activation in HPV-positive tongue carcinoma samples (mobile tongue and base of the tongue). In the context of this thesis, preliminary analysis of the PI3K/mTOR pathway in anal premalignant lesions and TCGA data for HNSCC supports and highlights the relevance of the phenotype described in the TG-E6/E7 anal canal and tongue with pS6 expression. These results provided the basis for the subsequent objective. To better understand the possible role of the PI3K/mTOR signaling pathway in the initiation and/or progression of squamous carcinogenesis in the studied epithelia, a conditional knock-in mouse line with a frequently reported activating mutation in phosphatidylinositol-3-kinase (PIK3C) was used. Double transgenic animals (K14CreER TAM / Pik3ca H1047R : K14/PI3K) were generated. PI3K activation was confirmed, and the phenotype of K14/PI3K animals was studied for up to 4 months. Morphological analysis of the K14/PI3K anal canal revealed histological alterations such as hyperplasia with hyperkeratosis, and mild dysplasia was diagnosed in all cases. Regarding the tongue epithelium, it showed hyperkeratosis with mild cellular irregularities and epithelial changes compatible with mild or moderate dysplasia. The results demonstrate that the expression of activated PI3KC in the anal and lingual epithelium is sufficient to induce dysplasia in these tissues, suggesting that mTOR pathway activation plays a role in the development of premalignant lesions. Taking these results into account and having established a genetically defined system to study E6 and E7 expression in the anal and lingual mucosa, the third objective was to evaluate the interaction of activated PI3KC or K-ras expression in the anal and oral epithelium along with E6 and E7 expression in vivo. New K14CreER TAM / Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-rtTA flox / Tet-E6/E7/ Pik3ca H1047R animals (compound mice I) were generated and followed for up to 4 months. The compound animals developed alterations in the anal and lingual mucosa, but these were less severe than those described in the TG-E6/E7 model. The development of dysplasia varied between the anal canal and the tongue, with earlier morphological changes and, in some cases, severe dysplastic changes were observed only in the lingual epithelium. The anal mucosa of these animals showed increased pS6 expression, while in the tongue, labeling was patchy and dependent on the lesions developed. Therefore, we have not found evidence of a cooperative or synergistic effect between E6/E7 expression and PI3K activation in the anal and oral mucosa in our animal model this far. Regarding anal mucosa carcinogenesis, K14-CreER TAM /LSL-K-ras G12D/+ animals were also generated. These animals had previously been characterized in our laboratory for their oral phenotype. Here, anal lesions were studied, revealing low-grade dysplasias, abnormal CK14 expression patterns, and increased pS6 expression in the upper layers of the TG epithelium. This provides further evidence of the involvement of the mTOR pathway, in the context of Ras/Akt/mTOR signaling, in anal carcinogenesis according to our in vivo system. Future studies will evaluate possible synergy with E6/E7. Taken together, the results of this thesis demonstrate the involvement of HPV-16 E6 and E7 proteins in the early carcinogenic process of the anal mucosa and provide new insights into their role in specific head and neck regions. The mouse model developed and characterized here is particularly important, as no other in vivo models currently allow the investigation of carcinogenesis associated with HPV infection in the analyzed tissues. Furthermore, the observed increase in pS6 in both experimental and human lesions supports the need for more extensive future analyses to better understand the potential role of the PI3K/AKT/mTOR pathway in the development of these premalignant lesions induced by E6/E7, as well as its possible differential effects between the oral cavity and the anal canal. This could provide new insights into the epidemiological differences observed in human tissues, where HPV-16 prevalence is described in both the tongue and anal canal, but it proves to be oncogenic only in the anal mucosa.

Citación:

---------- APA ----------

Ayre, Marina. (2024). Análisis de factores determinantes para el desarrollo de lesiones premalignas en la mucosa oral y anal : rol de las oncoproteínas E6/E7 del virus del papiloma humano (VPH). (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7663_Ayre

---------- CHICAGO ----------

Ayre, Marina. "Análisis de factores determinantes para el desarrollo de lesiones premalignas en la mucosa oral y anal : rol de las oncoproteínas E6/E7 del virus del papiloma humano (VPH)". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7663_Ayre

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