Registro:
| Documento: | Tesis de Maestría |
| Título: | Biomarcadores de daño y estrés oxidativo en neutrófilos humanos expuestos a hierro y a cianotoxina microcistina LR/hepatotoxina |
| Título alternativo: | Biomarkers of damage and oxidative stress in human neutrophils exposed to iron and the cyanotoxin microcystin LR/hepatotoxin |
| Autor: | Chiesa, Iris Maribel |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL)
|
| Fecha de defensa: | 2024-11-19 |
| Fecha en portada: | 15 de abril de 2024 |
| Grado Obtenido: | Maestría |
| Título Obtenido: | Magíster de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Ambientales |
| Departamento Docente: | Departamento de Ciencias de la Atmósfera y los Océanos |
| Director: | Repetto, Marisa Gabriela |
| Jurado: | Salvador, Gabriela Alejandra; Semmartin, María Gisela; Bargiela, Martha Fidela |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7660_Chiesa |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7660_Chiesa.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7660_Chiesa |
| Ubicación: | AMB 007660 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Chiesa, Iris Maribel. (2024). Biomarcadores de daño y estrés oxidativo en neutrófilos humanos expuestos a hierro y a cianotoxina microcistina LR/hepatotoxina. (Tesis de Maestría. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7660_Chiesa |
Resumen:
Las floraciones o bloom de cianobacterias en diversos nichos ecológicos y zonas climáticas representan un problema de salud emergente. Estos fenómenos vinculados al cambio climático son temas de creciente importancia, tanto para Argentina como para el resto del mundo, en especial, por las características y el aumento en la frecuencia con que aparecen en cuerpos de aguas continentales. La principal fuente de exposición a las cianobacterias y sus toxinas es a través del agua de bebida o consumo. En Argentina, específicamente en las zonas de Salto Grande (Entre Ríos) y San Roque (Córdoba) las cianobacterias del género Microcystis sintetizan y liberan cianotoxinas al ambiente, especialmente en reservorios de agua (Giannuzzi y col., 2011) de consumo humano. La microcistina MC-LR/hepatotoxina (MC-LR) es una de esas cianotoxinas. Un oligopéptido con potente actividad hepatotóxica e inflamatoria con capacidad de aumentar la migración de neutrófilos humanos, la formación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y la capacidad fagocítica, como también, es promotora de la formación de tumores. El límite de concentración de MC-LR permitido en aguas de bebida es de 1 μg/L y la ingesta diaria tolerable (IDT) se calcula en 0,04 μg/kg de peso corporal. El objetivo de esta Tesis de Maestría es caracterizar el estrés y daño oxidativo celular y la participación de las especies activas del oxígeno asociados a la respuesta inflamatoria en células polimorfonucleares humanas (PMN), neutrófilos, expuestos a diferentes concentraciones de MC-LR/hepatotoxina y de hierro, el cual, potenciaría la formación de radicales libres mediante la reacción de Fenton/Haber Weiss. En relación a esto, se evaluaron los marcadores bioquímicos de daño y estrés oxidativo en un modelo experimental in vitro en PMN expuestas a dos agentes tóxicos ambientales, el hierro inorgánico (Fe2+ ) y la MC-LR. Se utilizaron las dosis de MC-LR definidas en las guías de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para aguas de red calculada en 1 μg MC-LR /L y 25 μg MC-LR/L, considerada en modelos experimentales sub agudos vinculadas con concentraciones 6 μg Fe2+ /L y 30 μg Fe2+ /L, adecuadas a partir del nivel estándar permitido en aguas de bebida por la OMS. Se empleó, también, una concentración de Fe2+ de 300 μg Fe2+ /L considerada en la literatura como tóxica. Los fenómenos inflamatorios se infirieron a partir de la determinación del consumo de oxígeno (∆O2) celular con un electrodo tipo Clark y la actividad del complejo enzimático nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido oxidasa (NADPH oxidasa) para la evaluación del estallido respiratorio (ER) y respuesta inflamatoria respectivamente; quimioluminiscencia espontánea de baja intensidad in situ (QL) para evaluar la generación de ROS, principalmente oxígeno singulete (1O2); daño oxidativo (DO) a biomoléculas, también medido por cuantificación de productos de oxidación de lípidos de membrana (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, TBARS) y de proteínas (carbonilos, CO); como el consumo de glutatión (antioxidante endógeno citosólico, GSH), con el propósito de estudiar la toxicidad de MC-LR en presencia de hierro. Se observó que la concentración de células en las técnicas empleadas para la evaluación de biomarcadores de estrés oxidativo e inflamación resultaron más sensibles en una concentración de 8 x 104 PMN/mL para las determinaciones de ∆O2 y QL y de 1,5 x 105 PMN/mL a 5 x 106 PMN/mL para las determinaciones espectrofotométricas. Los principales resultados mostraron que en el rango de concentraciones permitidas en agua, el Fe2+ no activa el ER, inhibe la actividad de NADPH oxidasa y disminuye el contenido de GSH en PMN, sin embargo, genera DO por oxidación de lípidos (QL), pero no de proteínas (CO), con la mayor concentración permitida. MC-LR activa ER, pero inhibe la actividad de NADPH oxidasa y genera DO con incremento de 1O2, oxidación de biomoléculas y consumo de GSH, aun en la concentración más baja, lo que sugiere que el DO intracelular está involucrado en los mecanismos de toxicidad. En presencia de ambos agonistas combinados, el Fe2+ , en la concentración máxima permitida en agua y en presencia de MC-LR (ambas concentraciones), aumenta el efecto activador del ER de MC-LR. Con la dosis tóxica de Fe2+ y subaguda de MC-LR, se inhibe la respuesta de ER de los PMN frente al estímulo, similar al efecto observado por el Fe2+ solo. En el rango de concentraciones permitidas la combinación de ambos no permite el aumento de QL que genera la máxima concentración permitida en agua de Fe2+ y ambas de MC-LR, debido probablemente a la disminución de la generación de ROS (oxígeno singulete) y del DO a las proteínas de los PMN que genera la combinación de los dos agonistas. La presencia de Fe2+ disminuye la oxidación de proteínas generada por MC-LR. La exposición a dosis permitidas de Fe2+ o de MC-LR en aguas de consumo y recreativas afecta la homeostasis redox intracelular de PMN, exponiendo a estas células, primera línea de defensa de un organismo a las infecciones, frente a un entorno tóxico y oxidativo que afecta su respuesta.
Abstract:
Blooms of cyanobacteria in various ecological niches and climatic zones represent an emerging health problem. These phenomena linked to climate change are issues of growing importance, both for Argentina and the rest of the world, especially due to the characteristics and the increase in the frequency with which they appear in bodies of continental waters. The main source of exposure to cyanobacteria and its toxins is through drinking water. In Argentina, specifically in the areas of Salto Grande (Entre Ríos) and San Roque (Córdoba), cyanobacteria of the Microcystis genus synthesize and release cyanotoxins into the environment, especially in water reservoirs. Microcystin MC-LR/hepatotoxin (MC-LR) is one of these cyanotoxins, it is an oligopeptide with potent hepatotoxic and inflammatory activity, as it increases the migration of human neutrophils, the formation of reactive oxygen species (ROS) and the ability phagocytic, as well as promoting tumor formation. The concentration limit of MC-LR allowed in drinking water is 1 μg/L and the tolerable daily intake (TDI) calculated at 0.04 μg/kg body weight. The objective of this Master's Thesis is to characterize cellular oxidative stress and damage and the participation of active oxygen species associated with the inflammatory response in human polymorphonuclear cells (PMN), neutrophils, exposed to different concentrations of MC-LR/hepatotoxin and of iron, which would enhance the formation of free radicals through the Fenton/Haber Weiss reaction. Biochemical markers of damage and oxidative stress were evaluated in an in vitro experimental model in human polymorphonuclear cells (PMN) exposed to two environmental toxic agents, inorganic iron (Fe2+ ) and MC-LR. The MC-LR doses defined in the World Health Organization (WHO) guidelines for tap water were used (1 μg MC-LR/L and 25 μg MC-LR/L, for sub-acute experimental models) and concentrations of 6 μg Fe2+ /L and 30 μg Fe2+ /L, considered from the standard level allowed by the WHO, and a Fe2+ concentration of 300 μg Fe2+ /L, considered toxic, was also used. Cellular oxygen consumption (∆O2) was determined with a Clark-type electrode and the activity of the enzyme complex nicotinamide adenine dinucleotide reduced phosphate oxidase (NADPH oxidase) for the evaluation of the respiratory burst (RB) and inflammatory response respectively; in situ low-intensity spontaneous chemiluminescence (CL) to evaluate the generation of ROS, mainly singlet oxygen ( 1O2); oxidative damage (OD) to biomolecules, also measured by quantification of oxidation products of membrane lipids (thiobarbituric acid reactive substances, TBARS) and proteins (carbonyls, CO); as well as the consumption of glutathione (endogenous cytosolic antioxidant, GSH), with the purpose of studying the toxicity of MC-LR in the presence of iron. It was observed that the concentration of cells at which the techniques used for the evaluation of biomarkers of oxidative stress and inflammation were most sensitive were 8 x 104 PMN/mL for the determinations of ∆O2 and CL and from 1,5 x 105 PMN/mL to 5 x 106 PMN/mL for spectrophotometric determinations. The main results showed that in the range of concentrations allowed in water, Fe2+ does not activate the ER, inhibits the activity of NADPH oxidase and decreases the GSH content in PMN, however it generates OD by lipid oxidation (CL), but not by proteins (CO), with the highest concentration allowed. MC-LR activates RB and generates OD with an increase in 1O2 , oxidation of biomolecules and consumption of GSH, even at the lowest concentration, suggesting that DO is involved in the toxicity mechanisms. In the presence of both agonists combined, Fe2+ , at the maximum concentration allowed in water and in the presence of MC-LR (both concentrations), increases the RB-activating effect of MC-LR. With the toxic dose of Fe2+ and subacute dose of MC-LR, the ER response of PMNs to the stimulus is inhibited, similar to the effect observed by Fe2+ alone. In the range of permitted concentrations, the combination of both does not allow the increase in CL that generates the maximum concentration allowed in water of Fe2+ and both of MC-LR, probably due to the decrease in the generation of ROS (singlet oxygen) and OD to the PMN proteins generated by the combination of both agonists. Exposure to permitted doses of Fe2+ or MC-LR in drinking and recreational waters affects the intracellular redox homeostasis of PMN, exposing these cells, the first line of defense of an organism to infections, to a toxic and oxidative environment that decreases its response.
Citación:
---------- APA ----------
Chiesa, Iris Maribel. (2024). Biomarcadores de daño y estrés oxidativo en neutrófilos humanos expuestos a hierro y a cianotoxina microcistina LR/hepatotoxina. (Tesis de Maestría. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7660_Chiesa
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Chiesa, Iris Maribel. "Biomarcadores de daño y estrés oxidativo en neutrófilos humanos expuestos a hierro y a cianotoxina microcistina LR/hepatotoxina". Tesis de Maestría, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7660_Chiesa
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