Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Diseño y síntesis de ligandos fluorescentes específicos para la detección de blancos proteicos |
| Título alternativo: | Design and synthesis of fluorescent ligands specific for the detection of protein targets |
| Autor: | Arrupe, Nicolás |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | CONICET. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman" (CIBION)
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| Fecha de defensa: | 2024-09-30 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Orgánica |
| Departamento Docente: | Departamento de Química Orgánica |
| Director: | Giordano, Luciana |
| Consejero: | Durán, Fernando Javier |
| Jurado: | Celej, María Soledad; Barja, Beatriz Carmen; Di Chenna, Pablo Héctor |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7649_Arrupe |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7649_Arrupe.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7649_Arrupe |
| Ubicación: | QUI 007649 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Arrupe, Nicolás. (2024). Diseño y síntesis de ligandos fluorescentes específicos para la detección de blancos proteicos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7649_Arrupe |
Resumen:
Las técnicas basadas en fluorescencia constituyen una herramienta fundamental en el proceso de desarrollo de nuevos fármacos. Son métodos robustos y económicos, que permiten evaluar en forma eficiente un gran número de compuestos siendo adecuados para llevar a cabo ensayos de Cribado de Alta Capacidad. Para el desarrollo de procedimientos convenientes de screening, se necesita un método simple donde se evalúe la unión del ligando a la proteína con alta sensibilidad. El desarrollo de este método comienza con el diseño y la síntesis de sondas fluorescentes que se conjugan a ligandos específicos de blancos proteicos. Una de las aproximaciones para desarrollar sondas fluorescentes, involucra la incorporación de fluoróforos sensibles al entorno del tipo solvatocrómicos y rotores moleculares. Éstos exhiben comúnmente una fluorescencia muy débil en ambientes polares y próticos pero muestran una fuerte fluorescencia en ambientes hidrofóbicos. Por lo tanto, se espera que la unión del ligando en el sitio de unión a la proteína blanco acerque al fluoróforo al bolsillo hidrofóbico y cause un aumento en la emisión de fluorescencia. En contraste, en ausencia de la proteína blanco, la sonda permanecerá en un buffer acuoso y exhibirá una fluorescencia débil. Este enfoque es novedoso ya que no implica una reacción enzimática para que el cambio en la señal ocurra y por ende se puede aplicar a cualquier blanco proteico que tenga un sitio de unión. En esta tesis se sintetizaron sondas fluorescentes a partir fluoróforos sensibles al entorno del tipo solvatocrómicos basados en 3-hidroxicromonas y rotores moleculares basados en BODIPYs. Para esto se sintetizaron los fluoróforos incluyendo un halogenuro de arilo en su estructura. Por otro lado, se obtuvieron ligandos específicos para los blancos proteicos a estudiar funcionalizados con alquinos terminales. De esta manera se generaron las sondas fluorescentes especificas usando la reacción de acoplamiento de Sonogashira. En segundo lugar, se desarrolló un ensayo de unión ligando proteína que permitió calcular las constantes de unión de los sensores a las proteínas. A partir de esto, también se implementó un ensayo de desplazamiento que permite calcular constantes de disociación de ligandos específicos de la proteína blanco. Finalmente se realizaron diversos estudios computacionales que permitieron profundizar en la dinámica de la unión de las sondas a los distintos sistemas proteicos, entender la reactividad de los fluoróforos usados respecto a la reacción de Sonogashira, y como anexo, comprender el efecto electrónico que tienen los sustituyentes en distintas 3- hidroxicromonas.
Abstract:
Fluorescence-based techniques are an important tool in the development of new drugs. They are robust and cost-effective methods for evaluating a large number of compounds and are suitable for High Throughput Screening (HTS) assays. In particular, fluorescence techniques, including anisotropy, Förster Resonance Energy Transfer (FRET), and fluorescence lifetime, are widely used in HTS assays. For the development of convenient screening procedures, a simple method for assessing the binding of the ligand to the proteins with high sensitivity is required. The development of this method begins with the design and synthesis of fluorescent probes that are conjugated to specific ligands of protein targets. One approach to developing fluorescent probes involves the incorporation of environmentally sensitive fluorophores, such as solvatochromic dyes, and molecular rotors. These compounds commonly exhibit weak fluorescence in polar and protic environments but show strong fluorescence in hydrophobic environments. Therefore, ligand binding at the target protein binding site is expected to bring the fluorophore closer to the hydrophobic pocket, causing an increase in fluorescence emission. In contrast, without the target protein, the probe will remain in an aqueous buffer and exhibit weak fluorescence. This approach is novel it can be used with any protein target that has a binding site and does not require an enzymatic reaction for the signal to change. In this thesis, fluorescent probes were synthesized using environmentally sensitive fluorophores based on 3-hydroxichromones and molecular rotors based on BODIPYs. To achieve this, fluorophores with an aryl halogenide were synthesized. Additionally, specific ligands for target proteins functionalized with terminal alkynes were obtained. This way, specific fluorescent probes were generated using the Sonogashira coupling reaction. Secondly, a ligand-protein binding assay was developed, allowing the calculation of binding constants for the sensors to the proteins. Subsequently, a displacement assay was developed that allows the calculation of dissociation constants for ligands specific to the target protein. Finally, several computational studies were conducted to better understand the dynamics of probe binding to different protein systems, the reactivity of the fluorophores used in the Sonogashira reaction, and, as an annex, comprehend the electronic effects that substituents have in different 3-hydroxichromones.
Citación:
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Arrupe, Nicolás. (2024). Diseño y síntesis de ligandos fluorescentes específicos para la detección de blancos proteicos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7649_Arrupe
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Arrupe, Nicolás. "Diseño y síntesis de ligandos fluorescentes específicos para la detección de blancos proteicos". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7649_Arrupe
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