Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Circuitos sensoriales en desarrollo : rol de la actividad eléctrica espontánea en el establecimiento y maduración de la vía aferente del sistema de línea lateral del pez cebra |
| Título alternativo: | Development of sensory circuits : role of spontaneous electrical activity in the establishment and maturation of the afferent pathway of the lateral line system in zebrafish |
| Autor: | Salatino, Lucía |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Farmacología
|
| Fecha de defensa: | 2024-08-23 |
| Fecha en portada: | 2024 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Plazas, Paola Viviana |
| Consejero: | Marengo, Fernando |
| Jurado: | Locatelli, Fernando Federico; Rayes, Diego Hernán; Sigot, Valeria |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | ACTIVIDAD ELECTRICA ESPONTANEA; LINEA LATERAL; PEZ CEBRA; NEURONAS AFERENTES; CELULAS CILIADASSPONTANEOUS ELECTRICAL ACTIVITY; LATERAL LINE; ZEBRAFISH; AFFERENT NEURONS; HAIR CELLS |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7605_Salatino |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7605_Salatino.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7605_Salatino |
| Ubicación: | BIO 007605 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Salatino, Lucía. (2024). Circuitos sensoriales en desarrollo : rol de la actividad eléctrica espontánea en el establecimiento y maduración de la vía aferente del sistema de línea lateral del pez cebra. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7605_Salatino |
Resumen:
Una de las preguntas clave de la neurociencia es cómo se forman los circuitos neuronales durante el desarrollo del sistema nervioso. Existen numerosas evidencias del papel que juegan los programas genéticos en este proceso; sin embargo, aún no está claro de qué manera la actividad eléctrica puede afectar la estructura y la función de los circuitos en formación. Los circuitos neuronales responsables de procesar la información sensorial se establecen en estadios tempranos del desarrollo. Una característica notable de este proceso es que depende de actividad eléctrica espontánea (AEE) que es generada dentro de los mismos órganos sensoriales. Este trabajo tiene por objetivo general develar de qué manera la AEE controla el correcto ensamblado de los circuitos sensoriales en desarrollo. Para ello usamos como modelo la línea lateral (LL) del pez cebra (Danio rerio). Este sistema mecanosensorial es superficial y muy fácilmente accesible, lo que permite su estudio y manipulación en el animal entero. La LL detecta los movimientos del agua y los cambios de presión relativos al cuerpo del animal. Comprende una serie de agrupaciones celulares, llamadas neuromastos (NM), que contienen células ciliadas (CC) mecanosensitivas inervadas por neuronas aferentes (NAs) glutamatérgicas, que llevan la información sensorial al sistema nervioso central, y por neuronas eferentes (NEs) que proyectan desde áreas centrales hacia la periferia y modulan la transducción sensorial. Las CC de la LL comparten características estructurales, moleculares y funcionales con las CC del oído interno de mamíferos. Debido a ello y su fácil accesibilidad, han sido ampliamente utilizadas como modelo para el estudio de las bases genéticas de la audición y el equilibrio. Entre los 2 y los 3 días post fecundación (dpf), las NAs de la LL extienden sus axones hacia áreas centrales y periféricas en pos de establecer los primeros contactos sinápticos. A los 5 dpf, el sistema ya es funcional y responde a estímulos externos. Se ha reportado que tanto las CC como las NA en desarrollo exhiben AEE. Sin embargo, aún no existen evidencias del rol de la AEE en el correcto ensamblado de la LL. A lo largo de esta tesis se presentan dos capítulos enfocados en responder este interrogante. Capítulo 1- Rol de la AEE en el establecimiento de las proyecciones axonales centrales de las NAs de la LL. Con el fin de develar cuál es el papel que juega la AEE en el ensamblado de los circuitos sensoriales en desarrollo, estudiamos in vivo el establecimiento de los árboles axonales (AAs) de las NAs que inervan el cerebro medio del pez. Analizamos los estadíos de 3 y 5 dpf para estudiar el rol de la AEE en el ensamblado de la vía aferente, en desarrollo y madura, respectivamente. Realizamos un análisis estructural detallado de los AAs centrales a partir de la expresión estocástica de la proteína fluorescente DsRed y del canal de potasio humano hKir2.1 con el fin de suprimir la excitabilidad neuronal. Como resultado obtuvimos embriones con NAs únicas silenciadas y marcadas con DsRed. Analizamos in vivo el crecimiento axonal y el establecimiento de los AAs centrales adquiriendo imágenes en un microscopio confocal. Nuestros resultados muestran que la supresión de la AEE en NAs únicas genera un desarrollo anómalo de los AAs centrales. Aquellas neuronas silenciadas exhibieron una disminución en la longitud de sus AAs, así como alteraciones en su complejidad, lo que provocó una disminución del área de inervación. Además, estudios in vivo de la dinámica de crecimiento axonal evidenciaron que los AAs silenciad os poseen mayor motilidad, exhibiendo tasas de elongación, retracción, formación y eliminación, mayores que las NAs WT. Más aún, los AAs silenciados presentaron una alteración en el tiempo de vida de sus ramas, así como una disminución en el número de varicosidades, sugiriendo una disminución en el número de sinapsis maduras. En conclusión, nuestros resultados sugieren que la AEE es necesaria tanto para el crecimiento y la maduración de los AAs de las NA, como para el establecimiento de la inervación a nivel central. Capítulo 2- Caracterización de los patrones de AEE en CC de la LL en desarrollo y su modulación. Trabajos previos han reportado la presencia de AEE en CC de la LL a 3 y 5 dpf, previo al comienzo de la detección de estímulos externos. Sin embargo, aún no se conocen las características de dicha actividad y cómo ésta se desarrolla a lo largo de la maduración del sistema. Con el objetivo de caracterizar los patrones de AEE de las CC en distintos estadíos del desarrollo, estudiamos in vivo los cambios transitorios de las concentraciones intracelulares de calcio (Ca). Para ello, utilizamos embriones transgénicos que expresan el sensor de Ca genéticamente codificado GCaMP7a selectivamente en CC, y realizamos estudios de Imaging de Ca in vivo en embriones enteros de pez cebra antes y durante el establecimiento de las sinapsis aferentes de la LL. Detectamos señales con distintas características temporales, las cuales discriminamos según su frecuencia. Nos abocamos a estudiar las señales de altas frecuencias, las cuales no habían sido descritas hasta el momento. Detectamos eventos de alta frecuencia, a los que denominamos picos de Ca, entre los 3 y 7 dpf, y observamos un mayor porcentaje de CC activas a los 4 dpf, donde se encontró, además, un máximo en la magnitud promedio de actividad por célula. En el oído interno de mamíferos, la tasa de la AEE está bajo el control de una vía eferente colinérgica que desciende del cerebro y hace sinapsis directamente con las CC de la cóclea. De manera similar, la vía eferente colinérgica de la LL contacta las CC y la transmisión sináptica está mediada por el receptor nicotínico homomérico α9. Sin embargo, aún se desconoce si las NEs de LL también modulan la AEE expresada por las CC en desarrollo. Con el fin de responder esta pregunta, realizamos estudios de Imaging de Ca in vivo en presencia de α-bungarotoxina, bloqueante del receptor nicotínico α9. Observamos una disminución en la frecuencia y en la duración de los picos de Ca, sugiriendo que la vía eferente colinérgica modula la AEE expresada en las CC en desarrollo. Nuestros resultados muestran evidencias in vivo de que la AEE cumple un rol crucial en el ensamblado y maduración del circuito neuronal aferente de la LL y, por otro lado, contribuyen a la caracterización de la AEE en CC en distintos estadíos de la LL para comprender mejor tanto su función como su modulación durante el desarrollo.
Abstract:
One of the key questions in neuroscience is how neuronal circuits form during nervous system development. While the role of genetic programs in this process is well established, it remains unclear how electrical activity may affect the structure and function of developing circuits. Neuronal circuits responsible for processing sensory information are established early in development, and a notable feature of this process is its dependence on spontaneous electrical activity (SEA) generated within the sensory organs. This study aims to uncover how SEA controls the p roper assembly of developing sensory circuits, using the lateral line (LL) system of zebrafish (Danio rerio). The LL detects water motion and pressure changes relative to the animal's body. It consists of a series of cellular clusters called neuromasts (NM), containing mechanosensitive hair cells (HC) innervated by glutamatergic afferent neurons (ANs) that transmit sensory information to the central nervous system, and efferent neurons (ENs) projecting from central areas to the periphery and modulating sensory transduction. LL HC share structural, molecular, and functional features with mammalian inner ear HC, making them widely used models for studying the genetic basis of hearing and balance. Between 2- and 3-days post fertilization (dpf), LL ANs extend their axons to central and peripheral areas to establish initial synaptic contacts. By 5 dpf, the system is functional and responds to external stimuli. Developing HC and ANs have been reported to exhibit SEA. However, the role of SEA in the proper assembly of the LL is still unknown. Throughout this thesis, we present two chapters focused on addressing this question. Chapter 1- Role of SEA in the establishment of central axonal projections of LL ANs. To uncover the role of SEA in the assembly of developing sensory circuits, we studied in vivo the establishment of axonal arbors (AAs) of ANs innervating the zebrafish hindbrain. We analyzed the central projections at 3 and 5 dpf to study the role of SEA in afferent pathway assembly, in both developing and mature stages, respectively. We performed a detailed structural analysis of central AAs based on stochastic expression of the fluorescent protein DsRed and the human potassium channel hKir2.1 to suppress neuronal excitability. As a result, we obtained embryos with single silenced ANs marked with DsRed. We analyzed axonal growth and central AA establishment in vivo by acquiring images on a confocal microscope. Our results show that suppressing SEA in single ANs leads to abnormal development of central AAs. Silenced neurons exhibited reduced AA length and alterations in complexity, resulting in a decrease of innervation area. Moreover, in vivo studies of axonal growth dynamics revealed that silenced AAs have increased motility, with higher elongation, retraction, formation and elimination rates compared to WT ANs. Furthermore, silenced AAs showed alterations in branch lifetime and decreased number of varicosities, suggesting a decrease in mature synapses. In conclusion, our results suggest that SEA is necessary for growth and maturation of AN AAs and for establishing central innervation. Chapter 2- Characterization of SEA patterns in developing LL HC and their modulation. Previous studies have reported presence of SEA in LL HC at 3 and 5 dpf, preceding the onset of external stimulus detection. However, the characteristics of this activity and its development throughout system maturation remain unknown. To characterize SEA p atterns in HC at different developmental stages, we studied in vivo transient changes in intracellular calcium (Ca) concentrations. To achieve this, we used transgenic embryos expressing the genetically encoded Ca sensor GCaMP7a selectively in HC, and perf ormed in vivo Ca imaging studies in living embryos before and during establishment of LL afferent synapses. We detected signals with different temporal characteristics, which we discriminated based on their frequency. We focused on studying high-frequency signals, which had not been described previously. We detected high-frequency events, which we called Ca peaks, between 3 and 7 dpf, and observed a higher percentage of active HC at 4 dpf and, we also found a peak in average activity magnitude per cell. In the mammalian inner ear, SEA rate is under control of a cholinergic efferent pathway descending from the brain and directly establishing synapses with cochlear HC. Similarly, the LL cholinergic efferent pathway contacts HC, and synaptic transmission is mediated by the homomeric nicotinic receptor α9. However, it is still unknown whether LL ENs also modulate SEA expressed by developing HC. To answer this question, we performed in vivo Ca imaging in the presence of α-bungarotoxin, a blocker of the α9 nicotinic receptor. We observed a decrease in Ca peak frequency and duration, suggesting that the cholinergic efferent pathway modulates SEA expressed in developing HC. Our results provide in vivo evidence that SEA plays a crucial role in the assembly and maturation of the LL afferent neuronal circuitry, and contribute to the characterization of SEA in HC at different LL stages for a better understanding of its function and modulation throughout development.
Citación:
---------- APA ----------
Salatino, Lucía. (2024). Circuitos sensoriales en desarrollo : rol de la actividad eléctrica espontánea en el establecimiento y maduración de la vía aferente del sistema de línea lateral del pez cebra. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7605_Salatino
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Salatino, Lucía. "Circuitos sensoriales en desarrollo : rol de la actividad eléctrica espontánea en el establecimiento y maduración de la vía aferente del sistema de línea lateral del pez cebra". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7605_Salatino
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