Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Identificación y caracterización bioinformática de nuevos efectores asociados a los sistemas de secreción de tipo VI en Escherichia coli productoras de toxina Shiga |
| Título alternativo: | Identification and bioinformatic characterization of new effectors associated with the type VI secretion system in Shiga toxin-producing Escherichia coli |
| Autor: | Riviere, Nahuel Agustín |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria - CONICET. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular (IABIMO)
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| Fecha de defensa: | 2024-08-15 |
| Fecha en portada: | 2024 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Departamento Docente: | Departamento de Química Biológica |
| Director: | Larzábal, Mariano |
| Director Asistente: | Marques Da Silva, Wanderson |
| Consejero: | López, Nancy Irene |
| Jurado: | Quiroga, Cecilia; Sisti, Federico Bernardo; Palomino, María Mercedes |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | TOXINA SHIGA; VIRULENCIA; EFECTORES; SISTEMAS DE SECRECION DE TIPO VI; MACROFAGOS; SOBREVIDA; COMPETENCIA; RNA-seq; ACTIVIDAD ANTIBACTERIANASHIGA TOXIN; VIRULENCE; EFFECTORS; TYPE VI SECRETION SYSTEMS; MACROPHAGES; SURVIVAL; COMPETITION; RNA-seq; ANTIBACTERIAL ACTIVITY |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7604_Riviere |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7604_Riviere.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7604_Riviere |
| Ubicación: | QUI 007604 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Riviere, Nahuel Agustín. (2024). Identificación y caracterización bioinformática de nuevos efectores asociados a los sistemas de secreción de tipo VI en Escherichia coli productoras de toxina Shiga. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7604_Riviere |
Resumen:
Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) es un patógeno bacteriano implicado en enfermedades de transmisión alimentaria, cuya virulencia se debe principalmente a la producción de toxina Shiga (Stx). Esta toxina es responsable del desarrollo de síndrome urémico hemolítico (SUH), una complicación pediátrica grave de importancia en Argentina. E. coli enterohemorrágico (EHEC) pertenece a un subgrupo de STEC y dentro de este subgrupo se encuentra el serotipo O157:H7, que está asociado con brotes de SUH. Se ha identificado que el ganado bovino es el principal reservorio de STEC y la principal fuente de diseminación al ambiente y contaminación alimenticia. En el presente trabajo de tesis doctoral se investigaron dos cepas: EHEC O157:H7 EDL933 y STEC O22:H8 cepa 154, con el objetivo de identificar y caracterizar sus diferentes sistemas de secreción de tipo VI (SST6) y factores de virulencia (efectores) asociados. El SST6 es una nanomáquina proteica capaz de translocar moléculas efectoras que están vinculadas con la virulencia y que podrían aumentar su capacidad de colonización y supervivencia en un nicho específico. El análisis bioinformático realizado sobre el genoma de EHEC O157:H7 EDL933, permitió identificar una copia completa del operón SST6-2 codificado en el genoma bacteriano. Las predicciones bioinformáticas sobre la función del SST6-2, basándose en la homología de secuencia con otros patógenos que poseen este tipo de SST6-2 han revelado su asociación con la supervivencia de la bacteria en fagosomas de macrófagos murinos. Para demostrar esta predicción, se generaron cepas mutantes de EHEC para el SST6-2 mediante la metodología de edición génica CRISPR/Cas9, lo que ha permitido confirmar la relevancia que posee el SST6-2 en la supervivencia de la bacteria en macrófagos murinos. Para elucidar el mecanismo molecular de la supervivencia EHEC O157:H7 EDL933 en el macrófago se realizó un análisis de RNA-seq de la interacción hospedador-patógeno. Además, se tomó la decisión estratégica de replicar in vitro las condiciones de un fagosoma tardío. Este enfoque permitió obtener el perfil transcriptómico global de EHEC O157:H7 EDL933 fagocitada y expuesta a estrés extremo, observando una activación parcial de los genes estructurales del SST6-2. Para identificar nuevos efectores se empleó una combinación de predicciones bioinformáticas y datos experimentales recopilados de bibliografía. Esto condujo a la identificación de 98 potenciales efectores (26 provenientes de predicciones bioinformáticas y 72 de datos experimentales) del SST6-2 en EHEC O157:H7 EDL933. Al contrastar estos potenciales efectores con el resultado del RNA-seq considerando su sobreexpresión, localización subcelular se seleccionaron 38 candidatos a efectores del SST6-2. Teniendo en cuenta su función y la predicción sobre si estos potenciales efectores podrían contribuir a la virulencia bacteriana se redujo ese número a 6 potenciales efectores. Entre ellos YbjW que codifica para una proteína con actividad hidroxilamina reductasa y se encuentra asociado con la detoxificación frente al estrés nitrosativo. Por otro lado, se identificaron 5 candidatos asociados con procesos metabólicos como FumB, PurB y SucD y otros como YbeL e YccJ con funciones desconocidas. Los resultados obtenidos condujeron a la formulación de un modelo de acción del SST6-2 donde su estructura ya se encuentre previamente ensamblada en la membrana bacteriana, mientras que las expresión y asociación de efectores al complejo ocurra al momento de ser gatillada la respuesta de translocación. Durante la segunda etapa del desarrollo de la tesis doctoral se investigó la presencia y accionar de potenciales efectores del SST6 en STEC O22:H8 cepa 154. Resultados previos reportados por Martorelli y colaboradores demostraron que el ganado bovino portador de STEC O22:H8 no fue colonizado por EHEC O157:H7, aunque el mecanismo detrás de esta exclusión competitiva era desconocido. En esta tesis doctoral se pudo evidenciar las bases moleculares de STEC O22:H8 154 durante la competencia bacteriana por el nicho contra EHEC O157:H7. El análisis bioinformático del genoma de STEC O22:H8 reveló la presencia de dos SST6 completos: el SST6-1 y SST6-2. La presencia de un SST6-1 en una cepa STEC O22:H8 es un evento significativo porque no se ha reportado previamente. Además, el análisis realizado permitió la identificación de potenciales efectores antibacterianos dentro y fuera de los operones del SST6. Otros estudios han informado que el SST6-1 está asociado con un fenotipo de competencia bacteriana, en el cual las cepas que lo poseen exhiben la capacidad de eliminar a otras. Para demostrar esta predicción se realizó un ensayo de competencia in vitro a través del cual se pudo confirmar la actividad antibacteriana de STEC O22:H8 154 contra EHEC O157:H7. Esto sugiere que STEC O22:H8 154 podría desplazar del nicho de colonización a EHEC O157:H7 mediante la competencia interbacteriana, al disponer de un SST6-1 y potenciales efectores antibacterianos.
Abstract:
Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is a bacterial pathogen implicated in foodborne illnesses, with its virulence primarily attributed to the production of Shiga toxin (Stx). This toxin is responsible for the development of hemolytic uremic syndrome (HUS), a severe pediatric complication of significant concern in Argentina. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) is a subgroup of STEC, with the serotype O157 being associated with HUS outbreaks. Cattle have been identified as the primary reservoir of STEC and the main source of environmental dissemi- nation and food contamination. In this doctoral thesis, two strains were investigated: EHEC O157 EDL933 and STEC O22 strain 154, with the objective of identifying and characterizing their different type VI secre- tion systems (T6SS) and associated virulence factors (effectors). The T6SS is a protein na- nomachine capable of translocating effector molecules linked to virulence, potentially enhancing their ability to colonize and survive in specific niches. Bioinformatic analysis of the EHEC O157 EDL933 genome identified a complete copy of the T6SS-2 operon encoded in the bacterial ge- nome. Bioinformatic predictions about the function of T6SS-2 revealed its association with bac- terial survival in murine macrophage phagosomes, based on sequence homology with other path- ogens possessing this type of T6SS-2. To demonstrate this prediction, EHEC mutant strains for T6SS-2 were generated using CRISPR/Cas9 gene editing, confirming the relevance of T6SS-2 in bacterial survival within murine macrophages. To elucidate the molecular mechanism of EHEC O157 EDL933 survival in macrophages, RNA-seq analysis of the host-pathogen interaction was performed. Additionally, an in vitro strategy was implemented to replicate the conditions of a late phagosome. This approach allowed for the acquisition of the global transcriptomic profile of phagocytized and stressed EHEC O157 EDL933, revealing partial activation of the structural 5 genes of T6SS-2. To identify new effectors, a combination of bioinformatic predictions and ex- perimental data from the literature was employed. This led to the identification of 98 potential effectors (26 from bioinformatic predictions and 72 from experimental data) of T6SS-2 in EHEC O157 EDL933. By cross-referencing these potential effectors with RNA-seq results and consid- ering their overexpression and subcellular localization, 38 candidates for T6SS-2 effectors were selected. Considering their function and predictions about their contribution to bacterial virulence, this number was reduced to six potential effectors. Among them, YbjW encodes a protein with hydroxylamine reductase activity associated with detoxification against nitrosative stress. Addi- tionally, five candidates were identified associated with metabolic processes such as FumB, PurB, and SucD, and others like YbeL and YccJ with unknown functions. The results led to the formu- lation of a model for T6SS-2 action, where its structure is pre-assembled in the bacterial mem- brane, while the expression and association of effectors with the complex occur upon triggering the translocation response. In the second phase of the doctoral thesis, the presence and action of potential T6SS ef- fectors in STEC O22 strain 154 were investigated. Previous results reported by Martorelli and collaborators showed that cattle carrying STEC O22 were not colonized by EHEC O157, although the mechanism behind this competitive exclusion was unknown. In this doctoral thesis, the mo- lecular bases of STEC O22 154 during bacterial competition for the niche against EHEC O157 were elucidated. Bioinformatic analysis of the STEC O22 genome revealed the presence of two complete T6SSs: T6SS-1 and T6SS-2. The presence of T6SS-1 in a STEC O22 strain is significant as it has not been previously reported. Additionally, the analysis identified potential antibacterial effectors within and outside the T6SS operons. Other studies have reported that T6SS-1 is asso- ciated with a bacterial competition phenotype, where strains possessing it exhibit the ability to eliminate others. To demonstrate this prediction, an in vitro competition assay was conducted, confirming the antibacterial activity of STEC O22 154 against EHEC O157. This suggests that STEC O22 154 could displace EHEC O157 from the colonization niche through interbacterial competition, utilizing T6SS-1 and potential antibacterial effectors. Therefore, a STEC O22 154 strain lacking the gene encoding Shiga toxin (Δstx) could be used as a new strategy to prevent intestinal colonization of cattle by EHEC O157, potentially reducing meat contamination and consequently decreasing HUS cases in humans.
Citación:
---------- APA ----------
Riviere, Nahuel Agustín. (2024). Identificación y caracterización bioinformática de nuevos efectores asociados a los sistemas de secreción de tipo VI en Escherichia coli productoras de toxina Shiga. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7604_Riviere
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Riviere, Nahuel Agustín. "Identificación y caracterización bioinformática de nuevos efectores asociados a los sistemas de secreción de tipo VI en Escherichia coli productoras de toxina Shiga". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7604_Riviere
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