Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Exploración de una nueva proteína para el diagnóstico y análisis del N-glicoma plasmático en la enfermedad de Chagas Crónica |
| Título alternativo: | Exploration of a novel protein for the diagnosis and analysis of plasma N-glycome in chronic Chagas Disease |
| Autor: | Ossowski, Micaela Soledad |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | CONICET. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres" (INGEBI)
|
| Publicación en la Web: | 2025-02-25 |
| Fecha de defensa: | 2024-07-12 |
| Fecha en portada: | 2024 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Gómez, Karina Andrea |
| Director Asistente: | Mariño, Karina Valeria |
| Consejero: | Alonso, Guillermo Daniel |
| Jurado: | Marcipar Sedlacek, Iván Sergio; Búa, Jacqueline Elena; D'Alessio, Cecilia |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | ENFERMEDAD DE CHAGAS CRONICA; ANTIGENO NOVEDOSO; DIAGNOSTICO; PRONOSTICO; TRYPANOSOMA CRUZI; REACTIVIDAD CRUZADACHRONIC CHAGAS DISEASE; NOVEL ANTIGEN; DIAGNOSIS; PROGNOSIS; TRYPANOSOMA CRUZI; CROSS-REACTIVITY |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7573_Ossowski |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7573_Ossowski.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7573_Ossowski |
| Ubicación: | BIO 007573 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Ossowski, Micaela Soledad. (2024). Exploración de una nueva proteína para el diagnóstico y análisis del N-glicoma plasmático en la enfermedad de Chagas Crónica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7573_Ossowski |
Resumen:
La enfermedad de Chagas (EC) es una zoonosis potencialmente mortal causada por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi que afecta a más de 8 millones de individuos en todo el mundo, especialmente en América Latina. Esta patología presenta una fase aguda generalmente asintomática que, sin tratamiento, progresará a una etapa crónica en la que el 70% de los individuos permanecerá sin manifestaciones clínicas demostrables mientras que el 30% restante presentará mega síndromes gastrointestinales y diversos grados de miocardiopatía. Durante la fase crónica, el diagnóstico se basa en la detección de anticuerpos anti-T. cruzi de tipo IgG debido a la escasa o nula cantidad de parásitos circulantes, aunque el rendimiento de las pruebas serológicas actuales para el diagnóstico de la EC crónica (EChc) es muy variable. Ninguna de ellas constituye por sí misma un ensayo “gold standard” con 100% de sensibilidad y especificidad, por lo que la exploración de nuevos biomarcadores para alcanzar un diagnóstico certero sigue siendo un desafío. En nuestro laboratorio, gracias a la construcción de bibliotecas de anticuerpos recombinantes a partir de células B de pacientes con la forma cardíaca de la EChc, se obtuvo el anticuerpo de cadena simple (scFv) 6B6 dirigido contra una proteína de alto peso molecular de T. cruzi. Esta proteína, aislada por inmunoprecipitación, fue reconocida por plasma de pacientes con EChc, pero no por muestras de individuos no infectados o con leishmaniasis cutánea mediante ensayos de Western-Blot. En la presente Tesis, mediante inmunoprecipitación y espectrometría de masa, se identificó al antígeno reconocido por el scFv 6B6 como una proteína de 2983 aminoácidos, no caracterizada hasta ese momento y a la cual se denominó Tc323 (código de acceso TcCLB.504087.20 en la base de datos TriTrypDB). El análisis filogenético, respaldado por evidencia experimental, demostró que esta proteína está altamente conservada entre las diferentes cepas de T. cruzi, y que carece de ortólogos en otros parásitos de importancia sanitaria como Trypanosoma brucei y Leishmania spp., lo que implica severos eventos de pérdida en la historia evolutiva de Tc323. En línea con los resultados anteriormente obtenidos, y teniendo en cuenta la imposibilidad de obtener a la proteína de longitud completa de manera recombinante por su tamaño molecular, empleamos un enfoque in-silico para predecir la estructura 3D de Tc323 y determinar sus dominios antigénicos. De esta manera, identificamos dos regiones de Tc323, denominadas D3 (residuos 1369 a 1447) y D6 (residuos 2635-2983), las que se clonaron en un sistema procariótico, se expresaron y purificaron mediante cromatografía de afinidad. La reactividad de rTcD3 y rTcD6 se evaluó mediante ELISA-in house, luego de su optimización, empleando plasmas de individuos con EChc con y sin sintomatología clínica, así como individuos no infectados por T. cruzi de diferentes regiones endémicas de América Latina (Argentina, Bolivia, Brasil, Colombia, México, Paraguay, El Salvador y Estados Unidos). Además, con el objetivo de evaluar la reactividad cruzada, se incorporaron al presente estudio muestras de pacientes con enfermedades infecciosas no relacionadas: dengue, filariasis, hepatitis B, hepatitis C, HIV, HTLV, Leishmania spp., leptospirosis, sarampión, toxoplasmosis, rubéola, esquistosomiasis, estrongiloidiasis, COVID-19 y sífilis. El potencial diagnóstico se validó mediante análisis de curvas ROC. Los parámetros de rendimiento (área bajo la curva (AUC), sensibilidad, especificidad y precisión) mostraron una alta exactitud diagnóstica de ambas moléculas para diferenciar a los individuos seropositivos de los seronegativos. Por otro lado, la alteración específica del N-glicoma plasmático ha sido asociada a numerosas patologías, y constituye un potencial biomarcador de prognosis para enfermedades inflamatorias crónicas. En función de ello, y dado la ausencia de algún parámetro medible que permita determinar la progresión de la EChc, exploramos el perfil de N-glicoma plasmático de los pacientes sin sintomatología clínica y con diferentes grados de alteraciones cardíacas. Los resultados mostraron que los pacientes cardíacos presentan una alteración en la sialilación de plasma, con una disminución significativa de las estructuras tetrasialiladas en los individuos infectados en comparación con los individuos sin sintomatología clínica y no infectados, donde la abundancia de especies tetrasialiladas correlaciona negativamente con la carga parasitaria en muestras de plasma de los pacientes infectados, independientemente de la sintomatología clínica. En conjunto, en esta Tesis se abordó un enfoque complementario parásito/huésped, identificando dos dominios antigénicos de la proteína Tc323 con alta capacidad diagnóstica, así como también cambios en la N-glicosilación de proteínas presentes en el plasma de los pacientes con potencial aplicabilidad clínica como biomarcador de prognosis de la EChc.
Abstract:
Chagas disease (CD) is a potentially lethal zoonosis caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi, affecting over 8 million individuals worldwide, particularly in Latin America. This condition typically manifests an asymptomatic acute phase that, without treatment, progresses to a chronic stage where 70% of individuals remain clinically silent, while the remaining 30% develop gastrointestinal mega-syndromes and varying degrees of cardiomyopathy. In the chronic phase, diagnosis relies on detecting anti-T. cruzi IgG antibodies due to the low or absent presence of circulating parasites. However, the performance of current serological tests for chronic Chagas disease (CCD) diagnosis is highly variable, lacking a definitive "gold standard" with 100% sensitivity and specificity, posing a challenge for precise diagnosis through exploration of new biomarkers. In our laboratory, by constructing recombinant antibody libraries from B cells of CCD patients with the cardiac form, we obtained the single-chain antibody (scFv) 6B6 targeting a high molecular weight T. cruzi protein. This protein, isolated by immunoprecipitation, was recognized by plasma from CCD patients but not by samples from uninfected individuals or those with cutaneous leishmaniasis using Western Blot assays. In this Thesis, the antigen recognized by scFv 6B6 was identified, through immunoprecipitation and mass spectrometry, as a 2983 amino acid protein named Tc323 (access number TcCLB.504087.20 in TriTrypDB). Phylogenetic analysis, supported by experimental evidence, demonstrated that Tc323 is high conserved among different T. cruzi strains, lacking orthologs in other clinically significant parasites such as Trypanosoma brucei and Leishmania spp., suggesting severe loss events in its evolutionary history. Due to its large molecular size, an in-silico approach was employed to predict the 3D structure of Tc323 and identify its antigenic domains, leading to the cloning, expression, and purification of two regions, D3 (residues 1369-1447) and D6 (residues 2635-2983), in a prokaryotic system. The reactivity of rTcD3 and rTcD6 was evaluated by in-house ELISA, optimized, and tested against plasma from CCD individuals with and without clinical symptoms, as well as individuals from Chagas-endemic regions in Latin America and those with unrelated infectious diseases. The diagnostic potential was validated using ROC curve analysis. The performance parameters (area under the curve (AUC), sensitivity, specificity, and accuracy) show high diagnostic accuracy for both molecules in distinguishing seropositive from seronegative individuals. Furthermore, considering the well described plasma N-glycan alterations described in chronic inflammation, and in the absence of measurable parameters to determine CCD progression, this study explored the plasma N-glycome profile in patients with varying degrees of cardiac involvement and without clinical symptoms. The results showed that cardiac patients present an alteration in plasma sialylation, with a significant decrease in tetrasialylated structures in infected individuals compared to individuals without clinical symptoms and uninfected individuals, where the abundance of tetrasialylated species correlates negatively with the parasite load in plasma samples from infected patients, regardless of clinical symptoms. In summary, this Thesis explored a complementary parasite/host approach, identifying two antigenic domains of the Tc323 protein with high diagnostic capacity and revealing changes in the N-glycosylation of proteins in the plasma of CCD patients, contributing to a potential clinical applicability as a prognostic biomarker for Chagas disease.
Citación:
---------- APA ----------
Ossowski, Micaela Soledad. (2024). Exploración de una nueva proteína para el diagnóstico y análisis del N-glicoma plasmático en la enfermedad de Chagas Crónica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7573_Ossowski
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Ossowski, Micaela Soledad. "Exploración de una nueva proteína para el diagnóstico y análisis del N-glicoma plasmático en la enfermedad de Chagas Crónica". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7573_Ossowski
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