Organización dinámica de los factores de transcripción de pluripotencia durante el ciclo celular de células madre embrionarias

Oses Oliveto, Camila Maite

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Organización dinámica de los factores de transcripción de pluripotencia durante el ciclo celular de células madre embrionarias
Título alternativo:	Dynamic Organization of Pluripotency Transcription Factors during the Cell Cycle of Embryonic Stem Cells
Autor:	Oses Oliveto, Camila Maite
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
Fecha de defensa:	2024-07-30
Fecha en portada:	julio 2024
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Departamento Docente:	Departamento de Química Biológica
Director:	Levi, Valeria
Director Asistente:	Guberman, Alejandra Sonia
Consejero:	Caramelo, Julio Javier
Jurado:	Vissio, Paula Gabriela; Bolontrade, Marcela Fabiana; Malacrida, Leonel S.
Idioma:	Español
Palabras clave:	CELULAS MADRE EMBRIONARIAS; CICLO CELULAR; CONDENSADOS; CROMATINA; DIFERENCIACION; DINAMICA; DISTRIBUCION NUCLEAR; ESPECTROSCOPIA DE CORRELACION DE FLUORESCENCIA; FACTOR DE TRANSCRIPCION; FOCI; NANOG; OCT4; PLURIPOTENCIA; SOX2CELL CYCLE; CHROMATIN; CONDENSATES; DIFFERENTIATION; DYNAMICS; EMBRYONIC STEM CELLS; FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY; FOCI; NANOG; NUCLEAR DISTRIBUTION; OCT4; PLURIPOTENCY; SOX2; TRANSCRIPTION FACTOR
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7569_OsesOliveto
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7569_OsesOliveto.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7569_OsesOliveto
Ubicación:	QUI 007569
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Oses Oliveto, Camila Maite. (2024). Organización dinámica de los factores de transcripción de pluripotencia durante el ciclo celular de células madre embrionarias. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7569_OsesOliveto

Resumen:

Las células madre pluripotentes (CMP) son un excelente modelo para el estudio de la regulación de la expresión génica durante el desarrollo y los procesos de diferenciación. Además, representan una promesa para la medicina regenerativa y el modelado de enfermedades debido a su capacidad única de autorrenovación y diferenciación hacia todos los tipos celulares. La pluripotencia está controlada por una extensa red regulatoria, dirigida por los factores de transcripción (TF) OCT4, SOX2 y NANOG que inducen genes que promueven la pluripotencia y reprimen aquellos involucrados en la diferenciación. La movilidad y distribución de los TF dentro del núcleo celular modulan su disponibilidad para interactuar con sus sitios blanco en la cromatina y en última instancia, pueden jugar un papel importante en la regulación de la expresión génica. En este contexto, en los últimos años se ha observado que muchos TF y componentes de la maquinaria transcripcional no se distribuyen homogéneamente en el núcleo celular, sino que se concentran en regiones específicas formando “condensados transcripcionales”. En estudios previos, demostramos que los TF de pluripotencia forman condensados en el núcleo de células madre embrionarias (CME). Además, observamos cambios en la dinámica y distribución de OCT4 y SOX2 durante la diferenciación, en estadios que preceden a la disminución de sus niveles de expresión. En los últimos años, se ha demostrado que el ciclo celular desempeña un papel central en el mantenimiento de la pluripotencia y en las decisiones sobre el destino celular de CMP. En este sentido, varios estudios sugieren que las células en fase G1 son sensibles a estímulos de diferenciación que promueven cambios en su programa de expresión, mientras que en otras fases son refractivas a estos estímulos. Nuestro grupo ha demostrado que la inhibición de la replicación del DNA interfiere con el cambio de expresión génica requerido para el inicio de la diferenciación. En este contexto, nos preguntamos si la distribución espacial de los TF de pluripotencia varía durante el ciclo celular. Hipotetizamos que la fase S, en la que la cromatina está en constante remodelación como consecuencia de la replicación del DNA, podría ser una "ventana de oportunidad" para ejecutar cambios en la distribución de los TF definiendo un nuevo paisaje de interacciones TF-cromatina que, posteriormente, deriven en un nuevo programa transcripcional. Para estudiar experimentalmente esta hipótesis, empleamos líneas de CME generadas en nuestro laboratorio, que expresan OCT4, SOX2 o NANOG fusionados a proteínas fluorescentes y métodos de microscopía confocal y espectroscopía de correlación de fluorescencia que nos permitieron evaluar cuantitativamente la distribución y dinámica de los TF en células vivas individuales. Para identificar la fase del ciclo celular de cada una de las células analizadas, estudiamos la distribución nuclear de la proteína PCNA (proliferating cell nuclear antigen) fusionada a RFP, la cual varía a lo largo del ciclo celular y, particularmente, durante las subfases de S. Nuestros resultados muestran que la distribución e interacciones TF-cromatina varían durante el ciclo celular, de forma específica para cada uno de los TF del core de pluripotencia. Por otra parte, observamos que las señales de diferenciación recibidas en la fase G1 desencadenan cambios masivos en la organización nuclear de los TF de pluripotencia y en sus interacciones con la cromatina durante etapas tempranas de la fase S siguiente, tan solo 4 h después del estímulo de diferenciación. En particular, las células en fase S temprana expuestas a la señal de diferenciación en G1 mostraron un número significativamente menor de condensados de OCT4 y SOX2 en comparación con las células en S temprano indiferenciadas. De acuerdo con la literatura, los condensados de OCT4 modulan la actividad de super-enhancers; en consecuencia, la disminución observada en el número de condensados podría estar relacionada con una pérdida de actividad de los super-enhancers esenciales para el mantenimiento de la pluripotencia. Además, observamos que un aumento de la marca epigenética H3K27me3 promueve una disminución significativa en el número de condensados de OCT4, de manera similar a lo que ocurre al inducir la diferenciación. Por último, las interacciones de OCT4 y SOX2 con la cromatina son más lentas en las células inducidas a diferenciarse, lo que podría relacionarse con una reorganización de la cromatina en esta ventana temporal previamente reportada en la literatura. Postulamos que esta redistribución en las interacciones TF-cromatina podría estar vinculada con la actividad pionera de estos TF. En contraste, NANOG presentó un comportamiento prácticamente opuesto a OCT4 y SOX2, consistente con su rol como factor de transcripción de pluripotencia naïve. Específicamente, detectamos interacciones más rápidas entre NANOG y la cromatina en las células en S temprano expuestas a la señal de diferenciación en G1, que podrían iniciar la disminución de la actividad de genes asociados a la pluripotencia. En conclusión, este trabajo proporciona nuevas perspectivas sobre la importancia del ciclo celular para el mantenimiento de la pluripotencia y aporta información relevante para comprender los mecanismos involucrados en la salida del estado pluripotente y las transiciones en el destino celular.

Abstract:

Pluripotent stem cells (PSCs) constitute an excellent model for studying the regulation of gene expression, development, and the differentiation processes. Additionally, they hold promise for regenerative medicine and disease modeling due to their unique ability for self-renewal and differentiation into all cell types. Pluripotency is controlled by an extensive regulatory network, orchestrated by the transcription factors (TFs) OCT4, SOX2, and NANOG. These TFs induce genes that promote pluripotency while repressing others involved in differentiation. The dynamic and distribution of TFs within the cell nucleus modulate their availability to interact with their chromatin target sites, potentially playing a role in gene regulation. Recent observations indicate that many TFs and transcriptional machinery components do not distribute homogeneously in the cell nucleus. Instead, they concentrate in specific regions, forming "transcriptional condensates." We have previously demonstrated that pluripotency TFs form condensates in the nucleus of embryonic stem cells (ESCs), and that their dynamical distribution responds to differentiation cues. These changes in the dynamics and distribution of OCT4 and SOX2 occur before the downregulation of their expression, suggesting that these changes in TF-chromatin interactions may contribute to redefining gene expression profiles during cell fate decisions. In recent years, it was demonstrated that the cell cycle plays a key role in maintaining pluripotency and determining the cell fate of PSCs. Specifically, studies suggest that cells in G1 phase are sensitive to differentiation stimuli in comparison to cells in other phases. Also, we have previously demonstrated that inhibiting DNA replication interferes with the ranscriptional changes required for the initiation of differentiation. In this context, we asked whether the nuclear organization of pluripotency TFs changes during the cell cycle. We hypothesized that the S phase, during which chromatin undergoes constant changes due to DNA replication, could be a "window of opportunity" to execute changes in TF distribution, defining a new landscape of TF interactions with their target sites on chromatin. To experimentally test this hypothesis, we used ESC lines generated in our lab expressing OCT4, SOX2, or NANOG fused to fluorescent proteins and transfected them with a plasmid encoding the protein proliferating cell nuclear antigen (PCNA) fused to RFP. This last protein allowed us to identify the different cell cycle phases based on its nuclear distribution. We used quantitative confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy to study the TFs organization and dynamics. Our results reveal that the distribution and interactions between the pluripotency TFs and chromatin change during the cell cycle, in a TF dependent manner. Additionally, differentiation signals received during the G1 phase trigger massive changes in the nuclear organization of the pluripotency TFs and their interactions with chromatin during the subsequent Early-S phase, only 4 hours after the induction of differentiation. In particular, Early-S cells exposed to differentiation signals in the preceding G1 phase showed a significantly lower number of OCT4 and SOX2 condensates compared to undifferentiated Early-S cells. As condensates are functionally linked to super-enhancer (SE) activity, and both OCT4 and SOX2 are associated with their regulation, the decrease in the number of condensates could be related to a subsequent loss of activity in SEs essential for maintaining pluripotency. Moreover, we observed that an increase in the epigenetic mark H3K27me3 promotes a significant decrease in the number of OCT4 condensates, similar to the observations in induced E-S cells. Furthermore, we observed longer lasting interactions of OCT4 and SOX2 with the chromatin in cells induced to differentiate, possibly associated with a previously reported chromatin reorganization in this time window. We speculate that this redistribution in TF-chromatin interactions may be related to their role as pioneer TFs. Finally, we observed an almost opposite behavior for NANOG, consistent with its role as a naive pluripotency transcription factor. Specifically, we detected faster interactions between NANOG and chromatin in Early-S phase cells exposed to differentiation signals in G1, suggesting a decrease in NANOG-chromatin interactions, thereby triggering the downregulation of pluripotency-related genes. In conclusion, this work provides new insights into gene regulation during pluripotency maintenance throughout the cell cycle and sheds light on how pluripotency TFs regulate the exit from the naïve pluripotency state and cell fate transitions.

Citación:

---------- APA ----------

Oses Oliveto, Camila Maite. (2024). Organización dinámica de los factores de transcripción de pluripotencia durante el ciclo celular de células madre embrionarias. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7569_OsesOliveto

---------- CHICAGO ----------

Oses Oliveto, Camila Maite. "Organización dinámica de los factores de transcripción de pluripotencia durante el ciclo celular de células madre embrionarias". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7569_OsesOliveto

Estadísticas:

Descargas totales desde :

Navegar

Colección

Tesis Doctoral