Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Estudio de la mutación PSEN1 (p.T119I), asociada a la Enfermedad de Alzheimer familiar, utilizando técnicas de edición genética y células madre pluripotentes inducidas humanas |
| Título alternativo: | Study of the PSEN1 mutation (p.T119I), associated with familial Alzheimer's disease, using genetic editing techniques, and induced human pluripotent stem cells |
| Autor: | Isaja, Luciana |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | CONICET - FLENI - Instituto de Neurociencias (INEU)
|
| Fecha de defensa: | 2024-04-30 |
| Fecha en portada: | 2024 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Departamento Docente: | Departamento de Química Biológica |
| Director: | Romorini, Leonardo |
| Director Asistente: | Surace, Ezequiel Ignacio |
| Consejero: | Saravia, Flavia Eugenia |
| Jurado: | Vellón, Luciano; Pitossi, Juan Fernando |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | ENFERMEDAD DE ALZHEIMER GENETICA; CMPih; NEURODEGENERACION; OVILLOS NEUROFIBRILARES; PLACAS AMILOIDESGENETIC ALZHEIMER'S DISEASE; hiPSCs; NEURONS; ORGANOIDS; NEURODEGENERATION; NEUROFIBRILLARY TANGLES; AMYLOID PLAQUES |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7510_Isaja |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7510_Isaja.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7510_Isaja |
| Ubicación: | QUI 007510 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Isaja, Luciana. (2024). Estudio de la mutación PSEN1 (p.T119I), asociada a la Enfermedad de Alzheimer familiar, utilizando técnicas de edición genética y células madre pluripotentes inducidas humanas. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7510_Isaja |
Resumen:
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una patología neurodegenerativa de gran relevancia en la actualidad, debido a su creciente prevalencia y su impacto socioeconómico. La EA está caracterizada por la degeneración progresiva de las células nerviosas, muchas veces de forma concurrente con la aparición de placas de beta-amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares en el cerebro (ONF). A medida que la población envejece, la prevalencia de la EA continúa en aumento, lo que subraya la urgente necesidad de enfoques innovadores en la investigación y terapia de esta enfermedad neurodegenerativa. La EA posee dos presentaciones: La EA esporádica (EAe) y la familiar (EAf). Esta última se caracteriza por la presencia de mutaciones genéticas específicas que se transmiten de generación en generación dentro de una familia. Estas mutaciones suelen estar alojadas en genes del procesamiento de la proteína precursora amiloide que genera los depósitos de amiloide; APP, PSEN1 y PSEN2. A diferencia de la forma esporádica de la EA, que suele desarrollarse en la edad avanzada, la EA hereditaria puede manifestarse en personas de entre 30 y 50 años. Los síntomas iniciales y la progresión de la enfermedad varían, pero en general, esta forma hereditaria suele tener un inicio más temprano y un curso más rápido, con un deterioro cognitivo más pronunciado. En ese sentido, las células madre pluripotentes inducidas humanas (CMPih) juegan un rol clave en el desarrollo de modelos de neurodegeneración que complementen los ya existentes por su potencialidad de generar modelos derivados de pacientes. Las CMPih son reprogramadas a partir de células adultas mediante la introducción de factores de transcripción específicos y, al ser obtenidas directamente del paciente a estudiar, mantienen casi intacto el contexto genético del mismo. Además, estas células poseen dos características fundamentales: la pluripotencia y la capacidad de autorrenovación. La pluripotencia se refiere a su capacidad para diferenciarse en una amplia gama de tipos celulares. Por otro lado, las CMPih pueden autorrenovarse indefinidamente en el laboratorio, lo que garantiza una fuente constante de células para investigaciones y aplicaciones terapéuticas. Recientemente, en Fleni se reportó una mutación novedosa en el gen de PSEN1 (c. C356T p. T119I) en un paciente con EA de origen temprano. Aún no existe información acerca del rol de esta mutación en la progresión del proceso neurodegenerativo. Nuestra hipótesis de trabajo es que la mutación en sí es causal de la EAf en esta familia. En este trabajo nos propusimos generar modelos para estudiar en profundidad el perfil patogénico causado por esta mutación utilizando CMPih. Para ello, en una primera instancia generamos mediante edición génica utilizando la tecnología CRISPR/Cas9 células HEK293T PSEN1 Knock-Out (KO). Sobre estas células realizamos luego co-transfecciones transitorias con plásmidos de expresión que codifican para APP wild-type (WT) y PSEN1 WT o mutantes (A246E y T119I) y cuantificamos mediante ensayos de ELISA específicos los niveles de Aβ40 y Aβ42 intracelulares. Este experimento dio como resultado que la mutación PSEN1 p.T119I presentó un fenotipo intermedio (menor aumento de la relación Aβ42/Aβ40) al compararlo con una mutación previamente reportada y validada (PSEN1 p.A246E). Luego generamos una línea de CMPih a partir de la reprogramación de fibroblastos dérmicos (FD) de un paciente portador de la mutación PSEN1 c. C357T p. T119I. Con este propósito, primero transducimos los FD del paciente con el vector lentiviral STEMCCA que codifica para los factores de reprogramación de Yamanaka (OCT-4, KLF4, SOX2 y c-MYC) y obtuvimos 3 clones, denominados FFAD1.1c1, FFAD1.2c4 y FFAD1.2c8, los cuales fueron posteriormente validados. Se estudiaron las siguientes características típicas de CMPih: formación de colonias multicelulares compactas con una alta relación núcleo/citoplasma y bordes de colonias marcados, alta actividad de Fosfatasa Alcalina (AP), expresión de marcadores asociados a la troncalidad y la pluripotencia, es decir la capacidad de diferenciarse a tipos celulares de las 3 capas embrionarias (ectodermo, mesodermo y endodermo). Corroboramos además el silenciamiento del casete de expresión STEMCCA, y que se conserve el cariotipo parental de los FD. Además, mediante estudios de filiación por análisis de microsatélites, demostramos que las CMPih reprogramadas y los FD parentales tenían el mismo perfil genético. Una vez seleccionado el clon para seguir trabajando, el FFAD1.2c4, renombrado FFAD1, a partir de ahora la línea de CMPih FFAD1, comenzamos a establecer modelos neuronales en 2 y 3 dimensiones para el estudio de la EA. A partir de este punto, además, se adicionaron 2 como control dos líneas de CMPih, OUWi003-A y UOWi002-A, las cuales fueron generadas desde FD de un paciente con EA portador de la mutación PSEN1 p.A246E y un pariente cercano no portador de la variante y sin EA. Utilizando estas tres líneas se generaron 2 modelos neuronales en 2 dimensiones, uno de neuronas genéricas inmaduras y otro de neuronas corticales, los cuales fueron validados por inmunofluorescencia y RT-qPCR de marcadores neuronales (PAX6, TUJ1, TBR1, TBR2, entre otros). Para facilitar la observación de las placas amiloides, establecimos además un modelo neural en 3 dimensiones (también conocido como organoides cerebrales) el cual fue validado por inmunofluorescencia de marcadores neurales. Luego, cuantificamos los niveles de los péptidos Aβ40 y Aβ42 y Tau fosforilado [pT231] por ELISA en precipitados y sobrenadantes neuronales. Observamos que la línea FFAD1 exhibió un incremento estadísticamente significativo en los niveles de p-Tau [T231] en comparación con las neuronas generadas a partir de la línea OUWi002-A (PSEN1 WT). También, evaluamos los depósitos de Aβ42 y P-tau [pT231] sobre cortes histológicos de los organoides cerebrales y medimos los niveles de Aβ42 y Tau fosforilado [pT231] por ELISA. Los cortes histológicos revelaron que los organoides cerebrales derivados de CMPih de ambas mutaciones en PSEN 1 (p.T119I y p. A246E) mostraron depósitos de placas de Aβ de forma generalizada como así también una disminución en los niveles de péptidos de Aβ42 en los sobrenadantes de los organoides derivados de las líneas de CMPih OUWi003-A (PSEN1 A246E) y FFAD1 (PSEN1 T119I) con respecto a los organoides derivados de la línea control OUWi002-A (PSEN1 WT) y un aumento en la fosforilación en Tau para ambas líneas portadoras de variantes de EA. Por último, realizamos un RNA-seq para encontrar los ARNm diferencialmente expresados en neuronas corticales de la línea de CMPih FFAD1 (PSEN1 T119I) en comparación con las de la línea PSEN1 WT (UOW002i.A). Se analizó el transcriptoma y se identificaron 85 genes diferencialmente expresados, con 34 regulados negativamente y 51 positivamente. Un análisis de ontología génica reveló un enriquecimiento en genes asociados al equilibrio homeostático celular, la membrana plasmática y funciones moleculares como el transporte de sustancias y la homeostasis del hierro. Se seleccionaron 13 genes para validar los resultados mediante RT-qPCR, confirmando las regulaciones observadas en el análisis por RNA-Seq. Al incluir la línea UOW003i-A (PSEN1 A246E), se detectaron ciertos genes (ACP5, NOS3, PROKR2, GPD1, TRPC6, THSD1 y TUBA4A) que compartían un modo de regulación similar con la línea FFAD1, por lo que podrían estar involucrados en mecanismos moleculares comunes asociados a la EA, convirtiéndolos en blancos terapéuticos potencialmente prometedores. En conclusión, los hallazgos de este trabajo respaldan la hipótesis de que la variante PSEN1 (c. C356T p. T119I) posee un rol patogénico en la Enfermedad de Alzheimer de herencia autosómica dominante.
Abstract:
Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative pathology of great relevance today, due to its increasing prevalence and socioeconomic impact. AD is characterized by the progressive degeneration of neurons, often concurrently with the appearance of beta-amyloid plaques (Aβ) and neurofibrillary tangles (NFT) in the brain. As the population ages, the prevalence of AD continues to rise, emphasizing the urgent need for innovative approaches in the research and therapy of this neurodegenerative disease. AD has two presentations: sporadic AD (sAD) and familial AD (fAD). The latter is characterized by the presence of specific genetic mutations that are transmitted from generation to generation within a family. These mutations are often located in genes involved in amyloid precursor protein processing that generate amyloid deposits; APP, PSEN1, and PSEN2. Unlike in sAD, which typically develops in old age, fAD can manifest in individuals aged between 30 and 50. The initial symptoms and progression of the disease vary, but in general, this hereditary form tends to have an earlier onset and a faster course, with more pronounced cognitive decline. In this regard, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) play a key role in the development of neurodegeneration models that complement existing ones due to their potential to generate patient-derived models. hiPSCs are reprogrammed from adult cells by introducing specific transcription factors and, by being obtained directly from the patient under study, they maintain almost intact the patient's genetic context. Additionally, these cells possess two fundamental characteristics: pluripotency and self-renewal capacity. Pluripotency refers to their ability to differentiate into a wide range of cell types. On the other hand, hiPSCs can self-renew indefinitely in the laboratory, ensuring a constant source of cells for research and therapeutic applications. Recently, a novel mutation in the PSEN1 gene (c. C356T p. T119I) was reported at Fleni in a patient with early-onset AD. There is still no information about the role of this mutation in the progression of the neurodegenerative process. Our working hypothesis is that the mutation itself is causative of fAD in this family. In this work, we aimed to generate models to study in depth the pathogenic profile caused by this mutation using hiPSCs. To do this, we first generated PSEN1 Knock-Out (KO) HEK293T cells through genome editing using CRISPR/Cas9 technology. We then performed transient co-transfections on these cells with expression plasmids encoding for APP wild-type (WT) and PSEN1 WT or mutants (A246E and T119I) and quantified intracellular Aβ40 and Aβ42 levels using specific ELISA assays. This experiment resulted in the finding that the PSEN1 p.T119I mutation exhibited an intermediate phenotype (lower increase in the Aβ42/Aβ40 ratio) compared to a previously reported and validated mutation (PSEN1 p.A246E). Next, we generated a hiPSC line from the reprogramming of dermal fibroblasts (DF) from a patient carrying the PSEN1 c. C357T p. T119I mutation. For this purpose, we first transduced the patient's DF with the STEMCCA lentiviral vector encoding the Yamanaka reprogramming factors (OCT-4, KLF4, SOX2, and c-MYC) and obtained 3 clones, named FFAD1.1c1, FFAD1.2c4, and FFAD1.2c8, which were subsequently validated. We studied the following typical characteristics of hiPSCs: formation of compact multicellular colonies with a high nucleus/cytoplasm ratio and marked colony edges, high alkaline phosphatase (AP) activity, expression of markers associated with stemness and pluripotency, i.e., the ability to differentiate into cell types of the 3 embryonic layers (ectoderm, mesoderm, and endoderm). We also confirmed the silencing of the STEMCCA expression cassette and the parental karyotype conservation of the DF. Additionally, through microsatellite analysis, we demonstrated that the reprogrammed hiPSCs and the parental DF had the same genetic profile. Once the clone FFAD1.2c4, re named FFAD1, was selected to continue working with. We began to establish neural models in 2 and 3 dimensions for the study of AD. At this point, two control hiPSC lines, OUWi003-A and UOWi002-A, were also added, which were generated from DF of an AD patient carrying the PSEN1 p.A246E mutation and a close relative without the variant and without AD. Using these three lines, we generated 2-dimensional neural models, one of immature generic neurons and another of cortical neurons, which were validated by immunofluorescence and RT-qPCR of neuronal markers (PAX6, TUJ1, TBR1, TBR2, among others). To facilitate the observation of amyloid plaques, we also established a 3-dimensional neural model (also known as cerebral organoids), which was validated by immunofluorescence of neural markers. We then quantified the levels of Aβ40 and Aβ42 peptides and phosphorylated Tau [pT231] by ELISA in neuronal precipitates and supernatants. We observed that the FFAD1 line exhibited a statistically significant increase in p-Tau [T231] levels compared to neurons generated from the OUWi002-A line (PSEN1 WT). Additionally, we evaluated the deposits of Aβ42 and P-tau [pT231] on histological sections of the cerebral organoids and measured the levels of Aβ42 and phosphorylated Tau [pT231] by ELISA. The histological sections revealed that the cerebral organoids derived from hiPSCs with both PSEN1 mutations (p.T119I and p.A246E) showed widespread Aβ plaque deposits as well as a decrease in Aβ42 peptide levels in the supernatants of the organoids derived from the OUWi003-A (PSEN1 A246E) and FFAD1 (PSEN1 T119I) hiPSC lines compared to the organoids derived from the control line OUWi002-A (PSEN1 WT) and an increase in Tau phosphorylation for both lines carrying AD variants. Finally, we performed RNA-seq to identify differentially expressed mRNAs in cortical neurons from the FFAD1 hiPSC line (PSEN1 T119I) compared to those from the PSEN1 WT line (UOW002i.A). The transcriptome was analyzed, and 85 differentially expressed genes were identified, with 34 downregulated and 51 upregulated. Gene ontology analysis revealed an enrichment in genes associated with cellular homeostatic balance, the plasma membrane, and molecular functions such as substance transport and iron homeostasis. Thirteen genes were selected to validate the results by RT-qPCR, confirming the regulations observed in the RNA-Seq analysis. By including the UOW003i-A line (PSEN1 A246E), certain genes (NOS3, ICAM4, HSPA6, TMEM87B, PROKR2, GRIN2A, TRP6, THSD1, and ADAMTS15) were detected to share a similar mode of regulation with the FFAD1 line, suggesting they could be involved in common molecular mechanisms associated with AD, making them potentially promising therapeutic targets. In conclusion, the findings of this study support the hypothesis that the PSEN1 variant (c. C356T p. T119I) has a pathogenic role in autosomal dominant inheritance Alzheimer's disease.
Citación:
---------- APA ----------
Isaja, Luciana. (2024). Estudio de la mutación PSEN1 (p.T119I), asociada a la Enfermedad de Alzheimer familiar, utilizando técnicas de edición genética y células madre pluripotentes inducidas humanas. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7510_Isaja
---------- CHICAGO ----------
Isaja, Luciana. "Estudio de la mutación PSEN1 (p.T119I), asociada a la Enfermedad de Alzheimer familiar, utilizando técnicas de edición genética y células madre pluripotentes inducidas humanas". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7510_Isaja
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