Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Operación electroquímica de peroxidasas DyPs : nuevas rutas catalíticas propician un desempeño catalítico superior |
| Título alternativo: | Electrochemical operation of DyP-type peroxidases : new catalytic routes promote superior catalytic performance |
| Autor: | Scocozza, Magalí Franca |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química, Física de Los Materiales, Medioambiente y Energía (INQUIMAE)
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| Fecha de defensa: | 2023-12-07 |
| Fecha en portada: | 2023 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Inorgánica, Química Analítica y Química Física |
| Director: | Murgida, Daniel Horacio |
| Director Asistente: | Martins, Ligia O. |
| Consejero: | Estrin, Darío Ariel |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7484_Scocozza |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7484_Scocozza.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7484_Scocozza |
| Ubicación: | Dep.QUI 007484 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Scocozza, Magalí Franca. (2023). Operación electroquímica de peroxidasas DyPs : nuevas rutas catalíticas propician un desempeño catalítico superior. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7484_Scocozza |
Resumen:
Operación electroquímica de peroxidasas DyPs: nuevas rutas catalíticas propician un desempeño catalítico superior. En los últimos años la economía circular ha cobrado un creciente interés como estrategia para una gestión sustentable de nuestros recursos y la reducción de residuos derivados de la actividad humana. El polímero aromático lignina, abundante en la naturaleza, es un excelente candidato para ser incorporado en la economía circular. Investigaciones recientes revelan que tanto hongos como bacterias pueden degradar este polímero en moléculas de alto valor, beneficiosas para la industria farmacéutica y cosmética, entre otras. Entre las enzimas más relevantes para este objetivo se encuentras las Dye Decolorizing Peroxidases (DyPs), hemoproteínas que no sólo depolimerizan lignina sino que también oxidan alcoholes fenólicos y no fenólicos, colorantes azoicos, antraquinónicos y metales como Fe(II) y Mn(II). Las DyPs presentan actividad óptima a pH ácido (3-4), en contraste con otras peroxidasas como HRP o MnP y pueden clasificarse en tres distintas clases según su estructura tridimensional. Esta Tesis se centra en el estudio de dos DyPs pertenecientes a las bacterias Bacillus subtilis (BsDyP; Clase 1) y Pseudomonas putida (PpDyP; Clase P). En primer lugar, se identifica una nueva forma de activación electroquímica para estas DyPs, a la que se llama método EQ, que no requiere la adición externa de peróxido de hidrógeno. Bajo estas condiciones, ambas enzimas evidencian un incremento significativo en su actividad con diversos sustratos, así como una extensión del rango de pH activo, y, en algunos casos, un desplazamiento del pH óptimo hacia valores neutros. Se logra, además, operar a BsDyP de manera electroquímica inmovilizada en electrodos biocompatibles, registrando turnovers mucho mayores que al usar peróxido de hidrógeno en condiciones idénticas, manteniendo alrededor del 30% de su actividad tras cinco días de operación. En segundo lugar, se determina que el método EQ se basa en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) iniciada por la transferencia electrónica al oxígeno disuelto. Propusimos un mecanismo catalítico extendido que incluye nuevas rutas desde el estado de reposo de la enzima hacia oxo-compuestos catalíticos ante la reacción con distintas ROS. Se testea la relevancia de cada rama del mecanismo extendido mediante atrapantes específicos para cada ROS, evaluando la inhibición de la actividad electroquímica y de la generación de los oxo-compuestos catalíticos. Para profundizar la caracterización del nuevo método de activación de DyPs, se lleva a cabo la expresión y purificación de cuatro mutantes de residuos del sitio distal de cada DyP. Analizamos sus perfiles de pH y parámetros cinéticos para la oxidación de dos sustratos con estas enzimas utilizando el método EQ y el tradicional con H₂Oz. determinando también el grado de participación de cada ROS para cada mutante. Estos resultados proporcionan información sobre el papel de cada residuo del sitio distal en relación con ambos métodos estudiados en esta Tesis.
Abstract:
Electrochemical operation of DyP-type peroxidases: new catalytic routes promote superior catalytic performance. In recent years, the circular economy has gained increasing interest as a strategy for sustainable management of our resources and the reduction of waste resulting from human activity. The aromatic polymer lignin, abundant in nature, is an excellent candidate for incorporation into the circular economy. Recent research reveals that both fungi and bacteria can degrade this polymer into high-value molecules, beneficial for the pharmaceutical and cosmetic industries, among others. Among the most relevant enzymes for this purpose are the Dye Decolorizing Peroxidases (DyPs), hemoproteins that not only depolymerize lignin but also oxidize both phenolic and non-phenolic alcohols, azo dyes, anthraquinones, and metals like Fe(II) and Mn(II). DyPs show optimal activity in acidic pH (3-4) in contrast to other peroxidases such as HRP or MnP,and can be classified into three distinct classes based on their three- dimensional structure. This Thesis focuses on the study of two DyPs from the bacteria Bacillus subtilis (BsDyP; Class 1) and Pseudomonas putida (PpDyP; Class P). Firstly, we identified a new electrochemical activation method for these DyPs, which we named the Echem method, which does not require the external addition of hydrogen peroxide. Under these conditions, both enzymes showed a significant increase in their activity with various substrates, as well as an extension of the active pH range, and in some cases, a shift of the optimal pH towards neutral values. Furthermore, we were able to operate the BsDyP electrochemically when immobilized on biocompatible electrodes. registering much higher turnovers than when using hydrogen peroxide under the same conditions, retaining about 30% of its activity after five days of operation. Secondly, we determined that the Echem method is based on the generation of reactive oxygen species (ROS) initiated by direct electron transfer to dissolved oxygen. We proposed an extended catalytic mechanism that includes new pathways from the enzyme's resting state to catalytic oxo-compounds when reacting with various ROS. We tested the relevance of each branch of the extended mechanism using specific scavengers for each ROS, evaluating the inhibition of the electrochemical activity and of the generation of catalytic oxo-compounds. To deepen the characterization of the new DyP activation method, we carried out the expression and purification of four mutants of residues from the distal site of each DyP. We analysed their pH profiles and kinetic parameters for the oxidation of two substrates with these enzymes using both the new method and the traditional one with H₂O₂, also determining the degree of participation of each ROS for each mutant. These results provided information on the role of each residue from the distal site concerning both discussed methods.
Citación:
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Scocozza, Magalí Franca. (2023). Operación electroquímica de peroxidasas DyPs : nuevas rutas catalíticas propician un desempeño catalítico superior. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7484_Scocozza
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Scocozza, Magalí Franca. "Operación electroquímica de peroxidasas DyPs : nuevas rutas catalíticas propician un desempeño catalítico superior". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2023.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7484_Scocozza
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