Efecto de la expresión de SPARC en células madre mesenquimales y análisis de su potencial para la generación de heridas

Lombardi, Antonella

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Efecto de la expresión de SPARC en células madre mesenquimales y análisis de su potencial para la generación de heridas
Título alternativo:	Effect of SPARC expression in Mesencgymal Stem Cells and analysis of their potential for wound regeneration
Autor:	Lombardi, Antonella
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	CONICET-FLENI. Instituto de Neurociencias (INEU)
Publicación en la Web:	2023-11-09
Fecha de defensa:	2023-07-20
Fecha en portada:	2023
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Director:	Luzzani, Carlos Daniel
Consejero:	Guberman, Alejandra Sonia
Jurado:	Chasseing, Norma A.; Atorrasagasti Fernández, María Catalina; Maymo, Julieta Lorena
Idioma:	Español
Palabras clave:	CELULAS MADRE MESENQUIMALES; SECRETOMA; SPARC; REGENERACION DE HERIDAS
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7370_Lombardi
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7370_Lombardi.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7370_Lombardi
Ubicación:	Dep.QUI 007370
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Lombardi, Antonella. (2023). Efecto de la expresión de SPARC en células madre mesenquimales y análisis de su potencial para la generación de heridas. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7370_Lombardi

Resumen:

Las células madre mesenquimales (CMM) han sido ampliamente estudiadas en los últimos 30 años por su gran potencial clínico. Numerosas evidencias muestran que los efectos restauradores y regenerativos de las CMM se deben principalmente a sus efectos paracrinos mediados por su secretoma. Estas células liberan factores de crecimiento y citoquinas que modulan procesos celulares como la proliferación, la diferenciación, la inmunomodulación, la migración, la angiogénesis y la supervivencia. El secretoma de las CMM está compuesto tanto por factores solubles, como por factores liberados dentro de vesículas extracelulares (VE). Los exosomas, que se encuentran entre las VE secretadas por las CMM, son pequeñas vesículas de entre 50 y 120 nm de diámetro que están demostrando ser una valiosa fuente de información específica así también como huellas digitales de la progresión de enfermedades y como potenciales biomarcadores en diferentes estados fisiopatológicos. Por otra parte, la regeneración de heridas es un proceso complejo que requiere la migración celular, el desarrollo de un entorno inflamatorio, la angiogénesis, la granulación, la formación de tejido, la re-epitelización y la remodelación de la matriz extracelular (ME). Las CMM y su secretoma tienen un papel activo en este proceso, y se ha demostrado que la aplicación terapéutica de estas células mejora los resultados de la cicatrización de heridas. Por este motivo, en los últimos años se han estudiado diferentes maneras de modificar y aumentar las capacidades regenerativas de las CMM con el objetivo de desarrollar posibles terapias para la curación de heridas cutáneas. SPARC, también conocida como osteonectina, parece ser un actor clave del proceso regenerativo. SPARC es una glicoproteína multifuncional que se une al Ca2+ y pertenece a la familia de las proteínas de la ME. En animales adultos, su expresión se limita en gran medida a los tejidos en reparación o remodelación ya sea por heridas, enfermedades o procesos naturales, como los huesos y la mucosa intestinal. Se ha demostrado que SPARC regula el mecanismo de acción de varios factores de crecimiento y angiogénicos, así como también interactúa con diversas integrinas y proteasas regulando su expresión y actividad. Todas estas proteínas intervienen en numerosos mecanismos asociados al proceso de cicatrización tales como la migración, proliferación, diferenciación, angiogénesis y supervivencia celular, por lo que SPARC podría tener un rol clave en la regulación de este proceso regenerativo. Como se mencionó anteriormente, las CMM son una herramienta prometedora para el desarrollo de futuras terapias. Hasta la fecha, se ha producido una rápida expansión de los estudios tanto preclínicos como clínicos que utilizan el secretoma derivado de las CMM con las ventajas de un sistema libre de células. Aunque este secretoma parece ser una terapia prometedora para diversas enfermedades y lesiones, todavía resta saber más sobre la generación, la naturaleza y la modificación del mismo. En este trabajo, analizamos el potencial regenerativo del secretoma de células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton de cordón umbilical. Dado que SPARC está implicada en la remodelación y ensamblaje de la ME, así como en la regulación de los procesos de migración y proliferación celular, entre otros, hipotetizamos que la sobreexpresión de SPARC en las CMM tiene un efecto directo sobre la composición de su secretoma y potencialmente les conferiría una mayor capacidad regenerativa. Para abordar nuestra hipótesis, modificamos mediante un sistema lentiviral simple y reproducible a las CMM para que sobreexpresen la proteína de secreción SPARC (+SPARC). Además, generamos una línea de células en las cuales noqueamos parcialmente la expresión de SPARC (KD-SPARC) con el fin de analizar en mayor profundidad el rol de esta proteína en el proceso regenerativo. Por otro lado, en busca de desarrollar en un futuro una plataforma biotecnológica que sea fácilmente trasladable a la clínica, nos propusimos poner a punto un sistema de cultivo en suspensión que permita hacer más eficiente el proceso de cultivar, amplificar y aislar el secretoma de las CMM. Los resultados obtenidos en el presente trabajo nos permiten concluir que el cultivo 3D de CMM puesto a punto es una plataforma eficiente que permite obtener grandes cantidades de células y aislar su secretoma, ahorrando tiempo y espacio de trabajo. Demostramos que modificamos la expresión de la proteína SPARC en las CMM con un protocolo simple y reproducible. Mediante ensayos in vitro utilizando queratinocitos y fibroblastos de piel humana tratados con el medio condicionado (MC) de CMM wild type (WT) y modificadas, demostramos que el secretoma de derivado de las CMM induce cambios sobre la migración y proliferación de las células tratadas. Más aún, estos cambios son SPARC-dependientes y tipo celular-específicos. Asimismo, el tratamiento con los MC de células WT, +SPARC y KD-SPARC en un modelo de cicatrización de heridas in vivo, nos permitió reforzar los resultados obtenidos anteriormente, observando una aceleración del proceso regenerativo con MC de células +SPARC y un evidente retraso en la cicatrización de los ratones tratados con el MC derivado de CMM KD-SPARC. En conjunto, estos hallazgos demuestran que SPARC cumple un clave en el proceso de cicatrización de heridas cutáneas, convirtiéndolo en un blanco terapéutico de interés que debe continuar siendo estudiado y caracterizado con el objetivo de desarrollar a futuro terapias regenerativas más eficientes.

Abstract:

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been extensively studied in the past 30 years due to their significant clinical potential. Numerous pieces of evidence demonstrate that the restorative and regenerative effects of MSCs are primarily mediated by their paracrine effects through their secretome. These cells release growth factors and cytokines that modulate cellular processes such as proliferation, differentiation, immunomodulation, migration, angiogenesis, and survival. The secretome of MSCs is composed of soluble factors as well as factors released within extracellular vesicles (EVs). Exosomes, which are among the EVs secreted by MSCs, are small vesicles ranging from 50 to 120 nm in diameter that have proven to be a valuable source of specific information as well as fingerprints of disease progression and potential biomarkers in various pathophysiological states. On the other hand, wound regeneration is a complex process that involves cellular migration, the development of an inflammatory environment, angiogenesis, granulation, tissue formation, re-epithelialization, and remodeling of the extracellular matrix (ECM). MSCs and their secretome play an active role in this process, and therapeutic application of these cells has been shown to improve wound healing outcomes. For this reason, different approaches have been studied in recent years to modify and enhance the regenerative capabilities of MSCs with the aim of developing potential therapies for cutaneous wound healing. SPARC, also known as osteonectin, appears to be a key player in the regenerative process. SPARC is a multifunctional glycoprotein that binds to Ca2+ and belongs to the family of ECM proteins. In adult animals, its expression is largely limited to tissues undergoing repair or remodeling, whether due to wounds, diseases, or natural processes such as bone and intestinal mucosa. It has been demonstrated that SPARC regulates the action mechanism of various growth and angiogenic factors, as well as interacts with diverse integrins and proteases, regulating their expression and activity. All these proteins are involved in numerous mechanisms associated with the wound healing process, such as cell migration, proliferation, differentiation, angiogenesis, and cell survival. Therefore, SPARC could play a key role in the regulation of this regenerative process. As mentioned earlier, MSCs are a promising tool for the development of future therapies. To date, there has been a rapid expansion of both preclinical and clinical studies using the secretome derived from MSCs, with the advantages of a cell-free system. Although this secretome appears to be a promising therapy for various diseases and injuries, more knowledge is still needed about its generation, nature, and modification. In this study, we analyzed the regenerative potential of the secretome of mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly of the umbilical cord. Given that SPARC is involved in ECM remodeling and assembly, as well as in the regulation of cell migration and proliferation processes, among others, we hypothesized that the overexpression of SPARC in MSCs has a direct effect on the composition of their secretome and potentially confers them with greater regenerative capacity. To address our hypothesis, we modified MSCs to overexpress the secreted protein SPARC (+SPARC) using a simple and reproducible lentiviral system. Additionally, we generated a cell line in which SPARC expression was partially knocked down (KD-SPARC) in order to further analyze the role of this protein in the regenerative process. On the other hand, aiming to develop a biotechnological platform that can be easily translated to the clinic in the future, we set out to optimize a suspension culture system that allows for a more efficient process of culturing, amplifying, and isolating the MSC secretome. The results obtained in this study lead us to conclude that the optimized 3D culture of MSCs is an efficient platform that allows for the generation of large quantities of cells and isolation of their secretome, saving time and workspace. We demonstrated successful modification of SPARC expression in MSCs using a simple and reproducible protocol. Through in vitro assays using human skin keratinocytes and fibroblasts treated with conditioned media (CM) from wild-type (WT) and modified MSCs, we demonstrated that the secretome derived from MSCs induces changes in the migration and proliferation of the treated cells. Furthermore, these changes are SPARC-dependent and cell type-specific. Moreover, treatment with CM from WT, +SPARC, and KD-SPARC cells in an in vivo wound healing model allowed us to reinforce the previously obtained results, observing an acceleration of the regenerative process with CM from +SPARC cells and a clear delay in wound healing in mice treated with CM derived from KD-SPARC MSCs. Taken together, these findings demonstrate that SPARC plays a crucial role in the process of cutaneous wound healing, making it an interesting therapeutic target that should continue to be studied and characterized with the aim of developing more efficient regenerative therapies in the future.

Citación:

---------- APA ----------

Lombardi, Antonella. (2023). Efecto de la expresión de SPARC en células madre mesenquimales y análisis de su potencial para la generación de heridas. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7370_Lombardi

---------- CHICAGO ----------

Lombardi, Antonella. "Efecto de la expresión de SPARC en células madre mesenquimales y análisis de su potencial para la generación de heridas". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2023.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7370_Lombardi

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