Estudio de las dehidrinas y su relación con la tolerancia al estrés salino en la planta halófita Chenopodium quinoa Willd

Melgar, Alejandra Estefanía

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Estudio de las dehidrinas y su relación con la tolerancia al estrés salino en la planta halófita Chenopodium quinoa Willd
Título alternativo:	Study of dehydrins and their relationship with salt stress tolerance in the halophytic plant Chenopodium quinoa Willd
Autor:	Melgar, Alejandra Estefanía
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada (IBBEA)
Publicación en la Web:	2023-08-28
Fecha de defensa:	2023-07-25
Fecha en portada:	2023
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Director:	Zelada, Alicia Mercedes
Consejero:	Hopp, Esteban Horacio
Jurado:	Heinz, Ruth Amelia; Sutka, Moira Romina; Muschietti, Jorge Prometeo
Idioma:	Español
Palabras clave:	CHENOPODIUM QUINOA; DEHIDRINAS; ESTRES SALINO; VIGSCHENOPODIUM QUINOA; DEHYDRINS; SALT STRESS; VIGS
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7366_Melgar
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7366_Melgar.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7366_Melgar
Ubicación:	Dep.BIO 007366
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Melgar, Alejandra Estefanía. (2023). Estudio de las dehidrinas y su relación con la tolerancia al estrés salino en la planta halófita Chenopodium quinoa Willd. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7366_Melgar

Resumen:

La salinización de los suelos genera cada año pérdidas económicas millonarias en la agricultura, obligando a los productores a desarrollar nuevas estrategias agrícolas. Esto se debe a que la salinidad genera estrés en las plantas, provocando cambios significativos en su metabolismo y afectando su crecimiento y desarrollo, lo que a su vez impacta negativamente en la productividad de los cultivos. Para hacer frente a la salinidad y otras condiciones desfavorables del ambiente, las plantas han desarrollado diferentes mecanismos, como la acumulación de compuestos antioxidantes y de proteínas específicas involucradas en la tolerancia al estrés. Un ejemplo de estas proteínas son las dehidrinas, también conocidas como proteínas de respuesta a la deshidratación (DHNs por sus siglas en inglés, Dehydrin Proteins). Se trata de un grupo de proteínas que se encuentran en diversas especies vegetales y desempeñan un papel crucial en el desarrollo de las semillas y en la protección de las células contra el estrés ambiental, especialmente en condiciones de sequía, frío y salinidad. Estas proteínas tienen la capacidad de estabilizar las membranas celulares y de proteger las proteínas y el ADN contra el daño causado por la deshidratación. Por otro lado, quinoa (Chenopodium quinoa Willd) es una especie halófita facultativa adaptada para prosperar en una amplia gama de agroecosistemas. Algunas variedades pueden crecer incluso en concentraciones de sal similar o superior a la que posee el agua de mar. Sin embargo, aún no se comprenden completamente los mecanismos moleculares subyacentes que le confieren esta tolerancia. Por esta razón, realizar un estudio de las dehidrinas de quinoa y de su relación con la salinidad podría ayudar a dilucidar los mecanismos a través de los cuales las plantas responden al ambiente, y así desarrollar estrategias biotecnológicas más eficientes para generar plantas tolerantes al estrés. El objetivo principal de esta investigación fue la identificación y caracterización de la expresión de las dehidrinas de quinoa (CqDHNs) en respuesta al estrés salino. El propósito final consistió en utilizar estos genes como marcadores de tolerancia a la salinidad en la quinoa y como una herramienta de mejora para abordar el estrés salino en otros cultivos. Los objetivos específicos planteados y los resultados obtenidos se presentan a lo largo de tres capítulos. Las dehidrinas contienen segmentos conservados de aminoácidos, denominados segmentos K, S, Y y F que les confieren su estructura característica y son utilizados para clasificarlas en seis subgrupos estructurales: K, SK, YK, YSK, FSK y KS. El objetivo del primer capítulo consistió en realizar un análisis estructural y filogenético de las DHNs de angiospermas con el fin de establecer criterios adecuados que aseguraran la identificación exhaustiva de estas proteínas en los genomas de plantas. La identificación preliminar de DHNs en el genoma de 56 especies representativas del clado Viridiplantae utilizando el modelo oculto de Markov (HMM) definido para las proteínas de esta familia génica (Pfam00257) nos permitió determinar una falta de sensibilidad del método para el reconocimiento de DHNs en general, y en particular aquellas con estructura KS, lo que indica una subestimación de las DHNs codificadas en los genomas de plantas. En base a proteínas pertenecientes a los tres subgrupos estructurales KS, FSK e YSK se procedió a la construcción de tres nuevos perfiles de HMM denominados HMM-KS, HMM-F y HMM-Y. El perfil HMM-KS incrementó la sensibilidad en el reconocimiento de las DHNs y se determinó que una combinación de los perfiles HMM específicos de cada grupo es necesaria para la identificación de todos los tipos de DHNs. A continuación, se verificó la presencia de los motivos característicos de las DHNs utilizando la herramienta MEME. El análisis reveló que todas las DHNs KS poseen en la región amino-terminal un único motivo altamente conservado de 15 residuos, el cual no fue descripto anteriormente. Este motivo novedoso, al cual se denominó segmento H, fue detectado en las DHNs de especies angiospermas, gimnospermas y licofitas, sugiriendo que las DHNs HKS surgieron en las primeras plantas vasculares. Los análisis de filogenia y microsintenia indicaron que los cinco subgrupos estructurales de DHNs en angiospermas pueden ser asignados a tres grupos de genes ortólogos, caracterizados por la presencia de los segmentos H, F e Y. Finalmente, se evaluaron algunas propiedades biofísicas y bioquímicas a través de las cuales se concluyó que el carácter hidrofílico de las DHNs correlaciona con el origen filogenético de las DHNs más que con los subgrupos estructurales tradicionales. El segundo capítulo tuvo como objetivo la identificación de la familia génica de dehidrinas y el análisis de su expresión órgano-específico y en respuesta al estrés salino. Mediante el uso de los perfiles HMM descriptos en el primer capítulo, se identificaron 11 genes CqDHNs pertenecientes a los 3 grupos ortólogos de angiospermas. Se determinó la presencia de seis subgrupos estructurales de DHNs en el genoma de C. quinoa: FSK2, FSK3, Y2SK2, Y4SK2, SK y una atípica KS. Llamativamente, la dehidrina KS de C. quinoa no posee un segmento K conservado, sin embargo la presencia del dominio H y el análisis de microsintenia permitió identificarla como una proteína ortóloga a las DHNs KS. Llamativamente, estas mismas características fueron identificadas en las DHNs KS de las otras especies de amarantáceas analizadas. Se evaluó la expresión tejido específico de las CqDHNs y se obtuvo que los genes CqDHN1 (FSK2) y CqDHN3 (Y2SK2) se expresan de forma ubicua. En cambio, los genes CqDHN2 (FSK3) y CqDHN4 (Y4SK2 y SK2) se expresan exclusivamente en raíz e inflorescencia, respectivamente. Por otra parte, se realizaron ensayos de salinidad en plántula de tres variedades diferentes de quinoa. Estudios morfométricos y fisiológicos determinaron que Cahuil es la variedad más tolerante, siendo BO25 y Sajama los cultivares sensibles al estrés salino. Los análisis de qRT-PCR mostraron que los genes CqDHN4 aumentan su expresión a causa del estrés por sal en todas las variedades analizadas; mientras que los genes CqDHN1 disminuyen su expresión en Cahuil. Esto último es llamativo ya que la represión transcripcional de DHNs es muy inusual en estrés abiótico y existe un solo antecedente para salinidad reportado en hojas de Beta vulgaris, otra especie amarantácea con características halotolerantes. Un análisis in silico de los promotores de CqDHN1 y CqDHN4 identificó sitios de unión para CAMTA y ABF3, respectivamente. Ambos factores de transcripción están relacionados a múltiples estreses abióticos, y en particular a estrés osmótico, teniendo ABF3 un rol importante en respuestas dependientes de ABA. Consecutivamente, la función del gen CqDHN1A fue evaluada mediante sobreexpresión en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana. Los resultados indicaron que la sobreexpresión de CqDHN1A acorta los tiempos de germinación y favorece la elongación de la raíz en las plantas bajo condiciones normales de crecimiento. Sin embargo, el efecto positivo de CqDHN1A se pierde en condiciones de estrés salino debido a que el comportamiento de las líneas transgénicas no se diferencia significativamente de las plantas salvajes. Considerando que en Cahuil, la variedad de quinoa más tolerante al estrés salino, la expresión de CqDHN1 se regula negativamente, podemos plantear que la expresión de esta proteína en estadios tempranos del desarrollo de las plántulas podría ser negativo para su supervivencia en estrés salino. Por otra parte, estudios realizados sobre CqDHN4B mostraron que la proteína presenta cierto grado de degradación, y los ensayos preliminares de estrés no arrojaron resultados concluyentes. Se necesitarán evaluaciones adicionales para CqDHN4B que nos permitan comprender su rol en situaciones de estrés. El tercer y último capítulo planteó como objetivo el desarrollo de un sistema de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS por sus siglas en inglés, Virus-Induced Gene Silencing) para su utilización en ensayos de genómica funcional en quinoa. Se llevó a cabo una puesta a punto del método utilizando vectores virales basados en el virus de plantas Apple latent spherical virus (ALSV) que portan parte de las secuencias génicas de la fitoeno desaturasa de N. benthamiana y de quinoa. La técnica desarrollada requiere una primera inoculación en plantas de Nicotiana mediante agroinfiltración con cultivos de Agrobacterium que portan las diferentes construcciones virales. Se preparan extractos virales utilizando las hojas locales o sistémicas, y estos se usan como inóculo para infectar hojas de quinoa mediante daño mecánico. El método se probó exitosamente en dos variedades contrastantes de quinoa, aunque con algunas diferencias en el fenotipo de infección y la susceptibilidad viral. También se analizó el efecto del tamaño de la secuencia de inserción en los vectores virales, dando como resultado diferencias en el fenotipo de blanqueamiento o clorosis, y en el impacto sobre el crecimiento de las plantas. Se confirmó la presencia del virus en las plantas infectadas y se comprobó la disminución de la expresión del gen PDS en las plantas silenciadas. En conclusión, se pudo elaborar un método fácil y rápido de VIGS en quinoa que permitirá estudiar mediante pérdida de función diversos genes relacionados a estrés. Esto es sumamente relevante ya que se trata de una especie que hasta el momento no cuenta con protocolos de transformación estable, y por ende los estudios funcionales se encuentran restringidos a ensayos de expresión heteróloga.

Abstract:

Soil salinization generates significant economic losses in agriculture every year, forcing producers to develop new agricultural strategies. This is because salinity causes stress in plants, leading to significant changes in their metabolism and affecting their growth and development, which in turn negatively impacts crop productivity. To cope with salinity and other unfavorable environmental conditions, plants have developed different mechanisms, such as the accumulation of antioxidant compounds and specific proteins involved in stress tolerance. An example of these proteins are dehydrins, also known as dehydration response proteins or Dehydrin Proteins (DHNs for short). They are a group of proteins found in various plant species that play a crucial role in seed development and cell protection against environmental stress, especially under conditions of drought, cold, and salinity. These proteins have the ability to stabilize cell membranes and protect proteins and DNA from damage caused by dehydration. On the other hand, quinoa (Chenopodium quinoa Willd) is a facultative halophyte species adapted to thrive in a wide range of agroecosystems. Some varieties can even grow in salt concentrations similar to or higher than that of seawater. However, the underlying molecular mechanisms that confer this tolerance are not yet fully understood. Therefore, studying quinoa dehydrins and their relationship with salinity could help elucidate the mechanisms by which plants respond to the environment and develop more efficient biotechnological strategies to generate stress-tolerant plants. The main objective of this research was the identification and characterization of quinoa dehydrin (CqDHNs) expression in response to salt stress. The ultimate purpose was to use these genes as markers of salinity tolerance in quinoa and as an improvement tool to address salt stress in other crops. The specific objectives and results obtained are presented throughout three chapters. Dehydrins contain conserved segments of amino acids, referred to as K, S, Y, and F segments, which confer their characteristic structure and are used to classify them into six structural subgroups: K, SK, YK, YSK, FSK, and KS. The objective of the first chapter was to perform a structural and phylogenetic analysis of angiosperm dehydrins in order to establish appropriate criteria to ensure comprehensive identification of these proteins in plant genomes. The preliminary identification of dehydrins in the genomes of 56 representative species from the Viridiplantae clade using the hidden Markov model (HMM) defined for proteins of this gene family (Pfam00257) allowed us to determine a lack of sensitivity of the method for recognizing dehydrins in general, particularly those with KS structure, indicating an underestimation of dehydrins encoded in plant genomes. Based on proteins belonging to the three structural subgroups KS, FSK, and YSK, three new HMM profiles were constructed, named HMM-KS, HMM-F, and HMM-Y. The HMM-KS profile increased sensitivity in recognizing dehydrins, and it was determined that a combination of specific HMM profiles for each group is necessary for the identification of all types of dehydrins. Subsequently, the presence of characteristic motifs of dehydrins was verified using the MEME tool. The analysis revealed that all KS dehydrins possess a highly conserved unique motif of 15 residues in the amino-terminal region, which has not been described previously. This novel motif, referred to as the H segment, was detected in dehydrins from angiosperms, gymnosperms, and lycophytes, suggesting that HKS dehydrins emerged in early vascular plants. Phylogenetic and microsynteny analyses indicated that the five structural subgroups of dehydrins in angiosperms can be assigned to three groups of orthologous genes, characterized by the presence of the H, F, and Y segments. Finally, certain biophysical and biochemical properties were evaluated, leading to the conclusion that the hydrophilic nature of dehydrins correlates with their phylogenetic origin rather than with traditional structural subgroups. The second chapter aimed to identify the dehydrin gene family encoded in the quinoa genome and analyze the organ-specific expression and response to salt stress of CqDHNs. Using the HMM profiles described in the first chapter, eleven CqDHN genes were identified in the quinoa genome belonging to the Y-, F-, and H-orthologous groups found in angiosperms. Various analyses suggested a functional loss of the K segment in the H-type DHNs of quinoa and other amaranths. Likewise, the presence of six structural subgroups of CqDHNs (FSK2, FSK3, Y2SK2, Y4SK2, SK, and the atypical HS) was determined, with the majority having two paralogous genes (named A and B), which is consistent with quinoa's allotetraploid nature. Organ-specific expression of CqDHNs was evaluated, and it was found that the CqDHN1 (FSK2) and CqDHN3 (Y2SK2) genes are expressed ubiquitously. In contrast, the CqDHN2 (FSK3) and CqDHN4 (Y4SK2 and SK2) genes are expressed exclusively in the root and inflorescence, respectively. Furthermore, salinity tolerance analysis was conducted on seedlings of three different quinoa landraces. Physiological and morphometric studies determined that Cahuil is the most tolerant variety, while BO25 and Sajama are sensitive to salt stress. qRT-PCR analysis of salt-responsive gene expression showed that the CqDHN4 genes increase their expression due to salinity in all the studied landraces, whereas the CqDHN1 genes decrease their expression in Cahuil. Transcriptional repression of DHNs is unusual in abiotic stress, with only one precedent reported for salinity in beet leaves. In silico analysis of the promoters of CqDHN1 and CqDHN4 identified binding sites for CAMTA and ABF3, respectively. Both transcription factors are associated with multiple abiotic stresses, particularly osmotic stress, with ABF3 playing an important role in ABA-dependent responses. Subsequently, the function of the CqDHN1A gene was evaluated through overexpression in transgenic A. thaliana plants. Results indicated that CqDHN1 has a positive effect on the plant, reducing germination times and promoting root elongation rate. However, under salt stress conditions, germination and root growth are not promoted. Considering the downregulation of CqDHN1 in Cahuil, it was hypothesized that its heterologous overexpression under stress could be counterproductive for the plant. On the other hand, studies conducted on CqDHN4B revealed that the protein undergoes certain degrees of degradation, and preliminary stress tests did not yield conclusive results. Further evaluations of CqDHN4B will be necessary to better understand its role in stress situations. The third and final chapter aimed to develop a Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) system for functional genomics assays in quinoa. The method was fine-tuned using viral vectors based on the Apple latent spherical virus (ALSV) that carry partial gene sequences of phytoene desaturase from N. benthamiana and quinoa. The developed technique involves an initial inoculation in Nicotiana plants through agroinfiltration with Agrobacterium cultures carrying the different viral constructs. Viral extracts were prepared using local or systemic leaves, which were then used as inoculum to infect quinoa leaves through mechanical damage. The method was successfully tested in two contrasting quinoa varieties, although some differences were observed in infection phenotype and viral susceptibility. The effect of insertion sequence size in the viral vectors was also analyzed, resulting in differences in bleaching or chlorosis phenotype and impact on plant growth. The presence of the virus in infected plants was confirmed, and the reduction in PDS gene expression in silenced plants was verified. In conclusion, an easy and fast VIGS method in quinoa was developed, allowing the study of various stress-related genes through loss of function. This is highly relevant as quinoa currently lacks stable transformation protocols, limiting functional studies to heterologous expression assays.

Citación:

---------- APA ----------

Melgar, Alejandra Estefanía. (2023). Estudio de las dehidrinas y su relación con la tolerancia al estrés salino en la planta halófita Chenopodium quinoa Willd. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7366_Melgar

---------- CHICAGO ----------

Melgar, Alejandra Estefanía. "Estudio de las dehidrinas y su relación con la tolerancia al estrés salino en la planta halófita Chenopodium quinoa Willd". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2023.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7366_Melgar

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