Dinámica de los factores de transcripción de pluripotencia OCT4 y SOX2 en células madre pluripotentes embrionarias

Verneri, Paula

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Dinámica de los factores de transcripción de pluripotencia OCT4 y SOX2 en células madre pluripotentes embrionarias
Título alternativo:	Dynamics of the pluripotency transcription factors OCT4 and SOX2 in pluripotent embryonic stem cells
Autor:	Verneri, Paula
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
Fecha de defensa:	2023-07-14
Fecha en portada:	2023
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Departamento Docente:	Departamento de Química Biológica
Director:	Levi, Valeria
Director Asistente:	Guberman, Alejandra Sonia
Consejero:	Galigniana, Mario D.
Jurado:	Colman Lerner, Alejandro Ariel; Greco, Hernán E.; García, Mariana G.
Idioma:	Español
Palabras clave:	CELULAS MADRE EMBRIONARIAS; CELULAS MADRE PLURIPOTENTES; CITOESQUELETO; CONDENSADOS; DIFERENCIACION; DINAMICA DE INTERACCION; DISTRIBUCION NUCLEAR; ESPECTROSCOPIA DE CORRELACION DE FLUORECENCIA; FACTOR DE TRANSCRIPCION; FOCI; PLURIPOTENCIACONDENSATES; CYTOSKELETON; DIFFERENTIATION; DYNAMICAL INTERACTIONS; EMBRYONIC STEM CELLS; FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY; FOCI; NUCLEAR DISTRIBUTION; PLURIPOTENCY; PLURIPOTENT STEM CELLS; TRANSCRIOTION FACTOR
Formato:	PDF
Handle:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7350_Verneri
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7350_Verneri.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7350_Verneri
Ubicación:	QUI 007350
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Verneri, Paula. (2023). Dinámica de los factores de transcripción de pluripotencia OCT4 y SOX2 en células madre pluripotentes embrionarias. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7350_Verneri

Resumen:

Las células madre embrionarias (CME) tienen dos propiedades fundamentales que las diferencian de otros tipos celulares: son capaces de autorrenovarse, es decir, de dividirse dando células hijas iguales entre sí y a la que les dio origen, y son pluripotentes, ya que tienen la capacidad de diferenciarse generando todos los tipos celulares del organismo adulto. Comprender los mecanismos moleculares que gobiernan la pluripotencia es de suma relevancia, tanto para el área de la biología del desarrollo como por las promisorias aplicaciones de las células madre pluripotentes en la generación de modelos de enfermedades y en medicina regenerativa. El mantenimiento del estado pluripotente se debe principalmente a la acción de los factores de transcripción (TFs) OCT4, SOX2 y NANOG que, en conjunto, activan genes involucrados en la autorrenovación y pluripotencia y reprimen aquellos relacionados con la diferenciación. Al inducir la diferenciación, los niveles de NANOG, disminuyen rápidamente mientras que los de OCT4 y SOX2 se mantienen constantes durante la salida del estado de pluripotencia naïve. En los últimos años, se ha estudiado la relevancia de la compartimentalización nuclear en la regulación de la transcripción y se ha observado la existencia de “condensados transcripcionales” donde se concentran tanto factores de transcripción como la maquinaria transcripcional. Por otra parte, se ha determinado que las señales mecánicas cumplen un rol fundamental en el mantenimiento de la pluripotencia y en la diferenciación. En este contexto, la hipótesis de nuestro trabajo es que ciertos estímulos específicos, incluyendo señales químicas de diferenciación o mecánicas, modulan la distribución nuclear de los TFs de pluripotencia y su dinámica de interacción con la cromatina regulando así el perfil de expresión génica e impactando en el destino celular. Para testear esta hipótesis, nos propusimos estudiar la distribución y dinámica de OCT4 y SOX2 en CME en estado indiferenciado y al inicio de la diferenciación utilizando técnicas avanzadas de microscopía de fluorescencia. Además, analizamos la relación entre el citoesqueleto, estructura que interviene en la transmisión de señales mecánicas, y dicha distribución y dinámica. Para este estudio, utilizamos líneas estables de CME que expresan los TFs de interés fusionados a una proteína fluorescente (YPet) garantizando niveles de expresión estables, moderados y similares entre células. Nuestros estudios muestran que tanto SOX2 como OCT4 forman condensados o foci nucleares que colocalizan con regiones de cromatina compactada. Estos condensados se reorganizan de manera diferente durante la salida del estado pluripotente naïve, en una ventana temporal que precede a la disminución en los niveles de expresión de estos TFs (< 48 h). Estos resultados muestran que la distribución de los TFs y en particular la de OCT4, es sensible a señales de diferenciación. La formación de nuevos foci y los cambios en la cantidad de moléculas reclutadas podrían modular la concentración de los TFs en el nucleoplasma y su disponibilidad para interactuar con sus sitios blanco en el DNA, constituyendo un nivel extra en la regulación transcripcional durante la salida del estado de pluripotencia naïve. Utilizando espectroscopía de correlación de fluorescencia, determinamos que las interacciones TF-cromatina son distintas en foci y nucleoplasma; específicamente, una mayor proporción de TFs se encuentra unido a la cromatina en foci y lo hace por más tiempo. Además, la inducción de la diferenciación promueve cambios en las interacciones de OCT4 con la cromatina en la ventana temporal estudiada. En particular, una menor proporción de moléculas de OCT4 interactúa con la cromatina y lo hacen por menos tiempo en células inducidas a diferenciarse. Por otro lado, SOX2 presenta cambios muy sutiles en sus interacciones con la cromatina. Esta respuesta diferencial en la interacción TF-cromatina para OCT4 y SOX2 podría estar relacionada con las funciones que cumplen dichos TFs durante la salida del estado pluripotente naïve. Para analizar la relación entre las fuerzas transmitidas por el citoesqueleto y la organización y dinámica de los TFs, inicialmente caracterizamos la organización del citoesqueleto en CME por microscopía confocal, en tres dimensiones y en células vivas. Los pocos estudios disponibles hasta el momento sólo aportaban información proveniente de imágenes bidimensionales adquiridas en células fijadas químicamente. Además, estudiamos si el citoesqueleto modula la morfología nuclear y las interacciones OCT4-cromatina afectando para ello la integridad de las distintas redes de filamentos que lo componen. Observamos que las redes de actina y de filamentos intermedios de vimentina contribuyen a definir la morfología nuclear en forma opuesta. Específicamente, la red de actina transmite señales al núcleo deformándolo mientras que la red de vimentina protege a la organela de las fuerzas mecánicas. Por otro lado, las señales mecánicas transmitidas por la red de actina promoverían una disminución en el número de moléculas de OCT4 que se unen con la cromatina, mientras que la red de vimentina produciría el efecto contrario. Por otra parte, determinamos que la red de actina se encuentra involucrada en la organización de OCT4 en el núcleo celular, promoviendo una distribución más homogénea con menos condensados de OCT4 por célula. Llamativamente, observamos que la depolimerización de la red de microtúbulos no altera la organización intranuclear de este TF, pero promueve el transporte de OCT4 al citoplasma celular sugiriendo que esta red modula directa o indirectamente el transporte núcleo-citoplasma del TF. Estos resultados indicarían que las fuerzas mecánicas transmitidas hacia el núcleo pueden inducir cambios rápidos en la concentración y distribución de TFs, lo que en última instancia impactaría en las interacciones TF-cromatina. En el caso de los TFs de pluripotencia, esta reorganización podría definir los programas transcripcionales relacionados con el mantenimiento de la pluripotencia y el inicio de la diferenciación. En conclusión, en este trabajo mostramos que, tanto estímulos químicos que pueden inducir la salida del estado pluripotente naïve como señales mecánicas transmitidas por el citoesqueleto, tienen efectos relativamente rápidos y relevantes en la distribución nuclear de los TFs de pluripotencia OCT4 y SOX2 y en el paisaje de sus interacciones con la cromatina. Por último, queremos destacar que, por fuera de los objetivos inicialmente planteados en esta tesis y en el marco de la situación de emergencia excepcional que constituyó la pandemia causada por el SARS-CoV-2, desarrollamos un kit para la detección de SARS-CoV-2 por RT-qPCR, sin extracción de RNA, posteriormente autorizado por ANMAT y comercializado por una empresa argentina.

Abstract:

Embryonic stem cells (ESCs) have an unlimited possibility of self-renewal and are pluripotent, which means that they can give rise to all cell types derived from the three germ layers. Understanding the molecular mechanisms that govern pluripotency is crucial for both the comprehension of mammalian embryo development and for the applications of these cells in regenerative medicine. Pluripotency maintenance depends on the transcription factors (TFs) OCT4, SOX2 and NANOG that induce genes required to preserve pluripotency and repress others involved in differentiation. NANOG expression rapidly decreases while OCT4 and SOX2 levels remain stable at the onset of differentiation. In the last years, a wealth of evidence has shown that many nuclear components are organized in membraneless organelles. Particularly, the transcriptional machinery including several TFs concentrates in transcriptional condensates with elusive functions. On the other hand, other seminal contributions showed that forces applied to cells could modulate pluripotency maintenance and guide differentiation. In this context, our hypothesis is that specific stimuli such as chemical cues or mechanical forces modulate the distribution of pluripotency TFs in the nuclear space and define the concentration of TFs molecules available for interactions with chromatin targets therefore affecting cell fate decisions. To test this hypothesis, we studied the distribution and dynamics of OCT4 and SOX in undifferentiated ESCs and at the onset of differentiation by using advanced fluorescence microscopy techniques. Furthermore, we analyzed the relationship between the cytoskeleton, which is involved in force transmission, and the distribution and dynamics of these TFs. With this aim, we used stable cell lines that express OCT4 or SOX2 fused to the fluorescent protein YPet in an inducible manner. This system allows controlling the expression levels of the YPet-TFs and minimizes the large cell-to-cell variability observed with transient transfections. We found that OCT4 and SOX2 concentrate in chromatin-dense foci in undifferentiated ESCs that reorganize, in a TF-dependent manner, at early differentiation stages that precede their downregulation. The formation of new foci and/or the recruitment of molecules to these condensates may regulate the concentration of TFs in the nucleoplasm. By using fluorescence correlation spectroscopy, we detected that the interactions of OCT4 and SOX2 with chromatin are stronger in foci than in the nucleoplasm. Moreover, differentiation signals caused an impairment of OCT4-chromatin interactions in the nucleoplasm whereas SOX2 only showed a slight increase in the lifetime of short-lived interactions with the DNA. This different response to differentiation cues could be related with the different functions of these TFs during the exit of naïve pluripotency. In order to analyze the relationship between forces transmitted by the cytoskeleton and the dynamical organization of the pluripotency TFs, we studied the organization of the cytoskeleton in live ESCs using 3D confocal imaging. In contrast, a few previous reports only provided information of single-plane images of fixed cells. Moreover, we analyzed whether the cytoskeleton modulates the nuclear morphology and OCT4-chromatin interactions by disrupting the different cytoskeleton networks. Our results suggest that the actin network and vimentin intermediate filaments define the nuclear morphology in opposed ways. Actin transmits mechanical forces that deform the nucleus whereas vimentin protects the nucleus. On the other hand, the actin network communicates mechanical signals to the nucleus that seem to impair TF-chromatin interactions while vimentin affects OCT4 dynamics oppositely. In addition, the actin network promotes a more homogeneous distribution of OCT4 in the nucleus with a reduced number of foci. Surprisingly, microtubules depolymerization does not modify the TF intranuclear organization but favors OCT4 transport to the cytoplasm, suggesting that this network may modulate the nucleus-cytoplasm transport. Thus, forces transmitted to the nucleus trigger fast changes in the distribution and concentration of OCT4 in the nucleus, which ultimately could affect the OCT4-chromatin interactions. To conclude, we showed that chemical stimuli that triggers naïve pluripotency exit, and mechanical cues transmitted by the cytoskeleton produce a relatively fast reorganization of the pluripotency TFs in the nuclear space that affect the landscape of TF-chromatin interactions. This different landscape could contribute to defining the transcriptional programs associated with pluripotency maintenance or differentiation. Finally, we would like to highlight that, besides the initial aims of this thesis and in the context of the COVID-19 pandemic, we developed an extraction-free protocol for SARS-CoV-2 detection by RT-qPCR, authorized by ANMAT and commercialized by an argentine company.

Citación:

---------- APA ----------

Verneri, Paula. (2023). Dinámica de los factores de transcripción de pluripotencia OCT4 y SOX2 en células madre pluripotentes embrionarias. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7350_Verneri

---------- CHICAGO ----------

Verneri, Paula. "Dinámica de los factores de transcripción de pluripotencia OCT4 y SOX2 en células madre pluripotentes embrionarias". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2023.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7350_Verneri

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