La proteína de unión al ARNm Tristetraprolina (TTP) actúa como supresora tumoral en la carcinogénesis de cabeza y cuello

Ferri, Darío Martín

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	La proteína de unión al ARNm Tristetraprolina (TTP) actúa como supresora tumoral en la carcinogénesis de cabeza y cuello
Autor:	Ferri, Darío Martín
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias (IFIBYNE)
Publicación en la Web:	2023-08-28
Fecha de defensa:	2023-05-29
Fecha en portada:	abril 2023
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Director:	Raimondi, Ana Rosa
Consejero:	Nadra, Alejandro Daniel
Jurado:	Eiján, Ana María; Guberman, Alejandra Sonia; Schwint, Amanda Elena
Idioma:	Español
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7340_Ferri
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7340_Ferri.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7340_Ferri
Ubicación:	Dep.BIO 007340
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Ferri, Darío Martín. (2023). La proteína de unión al ARNm Tristetraprolina (TTP) actúa como supresora tumoral en la carcinogénesis de cabeza y cuello. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7340_Ferri

Resumen:

El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC) se produce en la cavidad bucal, la orofaringe, laringe o hipofaringe. El CCECC se encuentra entre los cánceres con mayor prevalencia a nivel mundial, y se caracteriza por una alta morbi-mortalidad. El carcinoma de células escamosas bucal (CCEB) representa más del 90% de los casos de cáncer bucal. La estabilidad de los ARN mensajeros (ARNm) está controlada por proteínas que se unen a secuencias enriquecidas en adenina y uracilo (ARE) en sus regiones 3' no traducidas (3' UTR) denominadas colectivamente proteínas de unión a AU (AUBP). Una de estas proteínas es la Tristetraprolina (TTP), la cual promueve la degradación de ARNs mensajeros con AREs en su 3’ UTR. TTP acelera el decaimiento de sus transcriptos blancos, muchos de los cuales codifican para citoquinas proinflamatorias (TNFα, IL-6 e IL-10). Además la expresión de TTP ha sido reportada disminuida en varios tipos de cáncer, entre ellos cáncer de colon y mama. Particularmente, también se ha reportado una disminución en la expresión de TTP en CCECC así como cambios en su expresión en diversas líneas células de CCECC, afectando la expresión de citoquinas proinflamatorias y procesos como la invasividad. Por lo tanto, comprender el rol de TTP en la homeostasis de la mucosa bucal, así como si la disminución de su expresión o alteraciones de la misma podrían predisponer a la iniciación y/o progresión carcinogénica bucal, aportaría datos de interés en el entendimiento del desarrollo de estos cánceres. Al respecto, en nuestro laboratorio se había desarrollado previamente un modelo murino modificado genéticamente para estudiar los efectos de la ablación de TTP específicamente en la cavidad bucal. Esos ratones TTP knock out (TTP-KO) se obtienen cruzando una línea direccionadora (K14-CreERTAM) con otra floxeada para TTP (TTPflox/flox). La ablación de TTP se logra induciendo el sistema con tamoxifeno (TAM). Entonces describimos que esos animales desarrollaban displasias en las lenguas KO luego de 2 meses de ocurrida la ablación. Por lo tanto, la hipótesis de trabajo de esta tesis fue la siguiente: la expresión de TTP protege a los queratinocitos orales de la iniciación y progresión tumoral evitando la activación de vías de señalización ligadas a la carcinogénesis y la respuesta inflamatoria.Se estudió el efecto de la ablación de TTP desde 1 hasta 8 meses post inducción del sistema transgénico. Los animales fueron saludables durante los 8 meses de seguimiento. Pero el análisis morfológico de esas lenguas reveló alteraciones histológicas como hiperplasias y acantosis luego de 1 mes de inducción del sistema. A los 2 meses se desarrollaban displasias leves, llegando a ser displasias moderadas a partir de los 4 meses y permaneciendo igual hasta los 8 meses. Además, a partir de los 2 meses se observaron infiltrados de células inmunes en el tejido conectivo subyacente a las lesiones. Esos infiltrados se componían de mastocitos y células supresoras mieloides derivadas de médula ósea (CD11b y Gr-1 positivas). Al cuantificarlas se encontró un aumento significativo de mastocitos en las lenguas TTP-KO entre los 2 y 3 meses post inducción, el cual se sostuvo hasta los 8 meses de seguimiento. Respecto a las células monocíticas, se encontró un aumento significativo de células CD11b positivas presentes en los infiltrados. Al evaluar los niveles de expresión de TNFα e IL-6, conocidos blancos de TTP, no se encontraron cambios estadísticamente significativos en su expresión respecto de las lenguas controles. En el caso de la expresión de TNFα, es de destacar que un análisis detallado de los casos reveló una dispersión en la expresión de TNFα tanto en el grupo control como en los animales TTP-KO. En relación a ello, una de las vías de señalización celular desreguladas en CCECC e implicada en la respuesta inflamatoria es la del NF-B. Por lo tanto, evaluamos el estado de activación de esta vía, encontrando aumentada significativamente la expresión de p65 y una disminución significativa de IBα, lo cual nos permite inferir una activación de la misma. En función de estos resultados, y dado que esa vía de señal es regulada positivamente por TNFα, decidimos evaluar si interferir con la actividad de TNFα en los animales TTP-KO podía ser suficiente para rescatar el fenotipo descripto. Para ello utilizamos etanercept, un receptor de TNFα soluble que inhibe los efectos del TNFα endógeno. Luego de 2 meses de tratamiento no se observaron diferencias morfológicas entre las lenguas control y KO, pero al cuantificar los mastocitos infiltrantes se encontró una disminución estadísticamente significativa de los mismos respecto de los animales sin tratar. Estos resultados indicarían que la actividad de TNFα jugaría un rol de relevancia en el reclutamiento de mastocitos en la lengua TTP-KO, sin afectar directamente los cambios epiteliales que serían desencadenados por la ausencia de función de TTP en los queratinocitos orales con NF-B activado. Con el siguiente objetivo de saber si TTP contribuye a la progresión tumoral estudiamos los efectos de su ablación junto al gen supresor de tumor p53, sin encontrar evidencias morfológicas de cooperación entre la ausencia de función de TTP y la de p53. Por el contrario, al evaluar el posible efecto cooperativo de K-Ras activado junto a la ablación de TTP se evidenció progresión y transformación maligna del epitelio de la lengua. Se generaron animales TTP-het/K-Ras y TTP-KO/K-Ras (grupos experimentales). Ambos grupos experimentales desarrollaron un fenotipo bucal y su sobrevida global se encontró disminuida significativamente respecto de los grupos control. Todos los animales experimentales desarrollaron lesiones premalignas en la lengua (hiperplasias verrugosas proliferativas y displasias). Un menor porcentaje de animales desarrollaron CCE, variante verrugosa. En base a estos resultados, nos preguntamos si las lesiones premalignas y CCE desarrollados en los animales TTP-KO con activación de K-Ras se producían solamente por la cooperación entre TTP y K-Ras o si el infiltrado inflamatorio contribuía de manera determinante a la progresión tumoral de la cavidad bucal de estos animales. El tratamiento con etanercept incrementó significativamente la sobrevida de los animales TTP-KO/K-Ras, aumentando un 40% la expectativa de vida del grupo tratado vs el grupo control. Los animales tratados presentaron cambios histológicos y CCE similares al grupo control, si bien el diagnóstico detallado reveló una clara tendencia al aumento de hiperplasias verrugosas proliferativas en los animales tratados. Además, los infiltrados inflamatorios de las lenguas tratadas con etanercept presentaron una disminución estadísticamente significativa de mastocitos en comparación a los controles. Por lo tanto, concluimos que el bloqueo de la actividad de TNFα incrementó la supervivencia de los animales TTP-KO/K-ras sin afectar la progresión de la carcinogénesis bucal. Finalmente, para validar y extender los resultados que obtuvimos con los modelos murinos estudiamos la expresión de TTP en CCECC humanos a través del análisis genómico de una base de datos del TCGA. Se encontró que a nivel mRNA la expresión de TTP sigue una distribución aproximadamente gaussiana y que esa población de carcinomas se puede dividir en tres grupos: bajo nivel de TTP (b-TTP), nivel medio TTP y alto TTP. Al comparar estos tres grupos entre sí según tiempo de sobrevida y tiempo libre de enfermedad no se encontraron diferencias significativas en esos parámetros al comparar pacientes con bajo o alto TTP con aquellos que mostraron valores medios. Al evaluar el impacto de los distintos niveles de la expresión de TTP sobre el grado histológico de los CCE encontramos que el grupo b-TTP mostró una incidencia significativamente mayor de carcinomas poco diferenciados que en los grupos con niveles medio o elevados de TTP. Estos resultados sugieren un impacto diferencial de TTP en cuanto a sobrevida y alteración en la diferenciación celular, coincidiendo en parte con lo observado en nuestro estudio del modelo murino TTP-KO, donde no hay cambios en la sobrevida pero sí en diferenciación tisular manifestada como desarrollo de lesiones premalignas, al igual que los CCE de pacientes con b-TTP. En su conjunto los resultados de esta tesis indicarían que la expresión de TTP en los queratinocitos orales tendría un rol de importancia en la iniciación tumoral. La expresión de TTP en los queratinocitos actuaría de manera protectora contra la carcinogénesis bucal al regular vías de señal asociadas a la tumorigénesis bucal, como la de NF-kB, que conjuntamente a la activación de un oncogén como K-Ras propiciaría el desarrollo de lesiones pre-malignas y carcinomas. Además, al trasladar la evidencia obtenida en modelos animales a CCECC humanos, a través del análisis del TCGA, encontramos cambios similares (sobrevida y diferenciación tisular) en pacientes con contextos genéticos equivalentes a los utilizados en el abordaje experimental.

Abstract:

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) arises in the oral cavity, oropharynx, pharynx and hypopharynx. HNSCC is one of the most prevalent cancers worldwide, characterized by high morbidity and mortality. Oral squamous cell carcinoma (OSCC) represents over 90% of all oral malignancies. Messenger RNA (mRNA) stability is controlled by proteins that bind to adenine and uracil-rich sequences (ARE) in their 3’ untranslated regions (3’ UTR) collectively known as AU binding proteins (AUBP). One of these proteins is Tristetraprolin (TTP), which promotes the degradation of mRNAs with AREs in their 3’ UTR. TTP accelerates the decay of its target transcripts, many of which encode proinflammatory mediators (TNFα, IL-6 and IL-10). Furthermore, TTP expression has been reported to be diminished in multiple cancer types, such as colon and breast cancer. A decrease of TTP expression has also been reported in HNSCC as well as changes in its expression in multiple HNSCC cell lines, altering proinflammatory mediators expression and invasion. However, the possible role of TTP in maintaining oral epithelium homeostasis and its abnormal expression in oral carcinogenesis has not yet been established in vivo. Our laboratory has previously generated a genetically engineered mouse model to study the consequences of TTP in the oral cavity. These tissue specific TTP knock out mice (TTP-KO) were generated by breeding a driver line (K14-CreERTAM) with mice harboring a floxed allele of TTP. TTP ablation is achieved by inducing this system with tamoxifen. We described the development of dysplasia in TTP- KO tongues 2 months after tamoxifen induction. Therefore, the hypothesis was the following: TTP expression protects oral keratinocytes from tumor initiation and progression preventing the activation of signaling pathways associated with carcinogenesis and inflammation. The impact of TTP ablation was studied from 1 to 8 months post induction of the transgenic system. All animals were healthy during the 8 months follow up. Tongues morphological analysis 1 month after system induction revealed histological alterations such as hyperplasia and acanthosis. Areas with mild dysplasia were described 2 months after induction, becoming moderate dysplasia after 4 months and remaining the same until 8 months. In addition to this, 2 months after induction we described immune cells infiltrating the connective tissue underlying these lesions. We characterized the immune cells and found mast cells and myeloid derived suppressor cells (CD11b and GR1-positive). Following quantification we found a significant increase of mast cells in TTP-KO tongues 2 to 3 months of evolution, which remained increased for the 8 months follow up. Regarding MDSC, we found a significant increase of CD11b positive cells in the infiltrates. When evaluating the expression levels of TNFα and IL-6, known targets of TTP, no significant changes in their expression could be found when comparing against control tongues. Notably, the dispersion of TNFα expression values was unexpectedly high in experimental samples, but also in control ones. This suggests that a non-controlled factor may differentially affect TNFα expression at individual level; alternatively, a natural heterogeneity may exist in tongues within the normal population with individuals presenting higher basal levels or more sensitive pathway response to naturally present stimuli. The NF-B pathway is one of the commonly deregulated signaling pathways in HNSCC and involved in the inflammatory response. Therefore, we analyzed the activation of said pathway, finding a significant increase in the expression of p65 and a significant reduction of IBα, suggesting an activation of the pathway. Given these results, and the fact that this pathway is positively regulated by TNFα, we decided to evaluate whether interfering with TNFα activity in TTP-KO mice could revert the described phenotype. The treatment of TTP-KO mice with etanercept, a soluble TNFα receptor that inhibits the effects of endogenous TNFα, led to changes in the inflammatory response. 2 months after treatment we could not observe morphological differences between control and KO tongues, however the mast cells were statistically significantly decreased in treated mice when compared with untreated mice. These results indicate that TNFα activity plays a relevant role recruiting mast cells in TTP-KO tongues. On the contrary, epithelial changes arising from the loss of function of TTP in the oral keratinocytes would be independent of TNFα activity, and more linked to NF-B pathway activation. To know if TTP contributes to tumor progression we studied the effects of both TTP and Tp53 ablation. We didn’t find morphological evidence of cooperation between the absence of function of TTP and p53 during oral carcinogenesis. On the contrary, when evaluating a potential cooperative effect between K-Ras activation along with TTP ablation we observed progression and malignant transformation of the tongue epithelium. We generated TTP-het/K-Ras and TTP-KO/K-Ras (experimental groups). Both experimental groups developed an oral phenotype and their survival was significantly reduced when compared against control groups. All experimental mice developed premalignant lesions in the tongue (proliferative verrucous hyperplasia -pvh- and dysplasia). A smaller percentage of animals developed well differentiated SCC, verrucous carcinomas like. Based on these results, we wondered if the premalignant lesions and SCC described in our mouse model were caused solely by the cooperation between TTP and K-ras or if the inflammatory infiltrates contributed in a determinant fashion to tumor progression in these animals. Etanercept treatment significantly increased the survival of TTP-KO/K-ras mice, increasing by 40% the life expectancy of the treated group vs the untreated group. Treated animals presented histological changes and SCCs similar to those of the control group, but detailed diagnosis revealed a tendency of increased premalignant lesions –pvh- in the treated group. In addition to this, the inflammatory infiltrates in etanercept treated tongues showed a significant reduction of mast cells when compared to the control group. Therefore, we conclude that TNFα blockade increased the survival of TTP-KO/K-ras mice without impacting oral carcinogenesis progression. Finally, to validate and extend our results generated with the mice models we studied the expression of TTP in human HNSCC through genomics analysis of a database from the TCGA. We found that mRNA levels of TTP loosely follow a normal distribution and therefore these carcinomas were divided in three groups: low TTP levels (l-TTP), medium TTP (m-TTP) levels and high TTP (h-TTP) levels. We compared survival and disease-free survival between these three groups and we could not find significant differences when comparing low or high TTP patients against medium TTP patients. Regarding the differentiation grade of the carcinomas we found statistically significant increases in the poorly differentiated SCCs in l-TTP group versus m-TTP and h-TTP groups. These results suggest a differential impact of TTP regarding survival and differentiation levels, partially matching what we observed in our TTP-KO mice model, where overall survival was not altered but we did see an alteration in tissue differentiation, shown by the development of premalignant lesions, in a similar fashion of SCC from l-TTP patients. Altogether, the results of this thesis indicate that TTP expression in oral keratinocytes would have a relevant role in tumor initiation. TTP expression would have a protective role against oral carcinogenesis by regulating signaling pathways associated with oral tumorigenesis, such as the NF-kB pathway. Furthermore, abnormal TTP expression would lead to the development of premalignant lesions and carcinomas when coupled with the activation of an oncogene such as K-Ras. In addition to this, when extending the evidence generated in our mice models to human HNSCC through the analysis of the TCGA database, we found similar changes (survival and tissue differentiation) in patients with an equivalent genetic context to those used in our experimental approach.

Citación:

---------- APA ----------

Ferri, Darío Martín. (2023). La proteína de unión al ARNm Tristetraprolina (TTP) actúa como supresora tumoral en la carcinogénesis de cabeza y cuello. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7340_Ferri

---------- CHICAGO ----------

Ferri, Darío Martín. "La proteína de unión al ARNm Tristetraprolina (TTP) actúa como supresora tumoral en la carcinogénesis de cabeza y cuello". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2023.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7340_Ferri

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