Análisis de la regulación transcripcional del gen RBFOX1 desde un enfoque evolutivo

Berasain, Lara

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Análisis de la regulación transcripcional del gen RBFOX1 desde un enfoque evolutivo
Título alternativo:	Transcriptional regulation analysis of RBFOX1 gene from an evolutionary approach
Autor:	Berasain, Lara
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	CONICET. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres" (INGEBI)
Fecha de defensa:	2023-05-08
Fecha en portada:	2023
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Consejero:	Rubinstein, Marcelo
Jurado:	Souza, Flavio Silva Junqueira de; Armas, Pablo; Fernandino, Juan Ignacio
Idioma:	Español
Palabras clave:	RBFOX1; REGULACION TRANSCRIPCIONAL; HARSRBFOX1; EVOLUCION DEL CEREBRO; TRANSCRIPTIONAL REGULATION; HARS; BRAIN EVOLUTION
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7326_Berasain
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7326_Berasain.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7326_Berasain
Ubicación:	Dep.BIO 007326
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Berasain, Lara. (2023). Análisis de la regulación transcripcional del gen RBFOX1 desde un enfoque evolutivo. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7326_Berasain

Resumen:

Descifrar cómo los cambios en las redes regulatorias de la expresión génica contribuyen a los rasgos humano-específicos es uno de los grandes propósitos de la biología evolutiva humana. Identificar tales cambios y establecer su impacto funcional es un gran desafío, principalmente debido a las dificultades para predecir la función de las secuencias no codificantes. Sin embargo, recientemente se han identificado posibles impulsores genéticos subyacentes a las características biológicas humanas, entre los que se destacan las Regiones Aceleradas en Humanos (HARs). Estos elementos están altamente conservados en la mayoría de las especies de mamíferos, pero muestran un exceso significativo de cambios humano-específicos en sus secuencias. El alto grado de conservación sugiere que están sujetos a restricciones funcionales, mientras que el aumento de la tasa de sustituciones en humanos podría indicar la adquisición de una función diferencial en nuestra especie. Se ha demostrado que numerosos HARs actúan como enhancers transcripcionales durante el neurodesarrollo, y algunos muestran diferencias de expresión espaciotemporal en comparación con sus secuencias ortólogas. A pesar de estos avances, la contribución de los HARs en la regulación génica in vivo sigue siendo poco conocida. En nuestro laboratorio hemos determinado que uno de los locus del genoma humano que acumula un alto número de secuencias HARs es el ocupado por el gen RNA-binding Protein, fox-1 homolog (RBFOX1), un factor de splicing alternativo que actúa principalmente en células neuronales, músculo esquelético y corazón. Además, su disfunción ha sido asociada con varios trastornos del neurodesarrollo. En este trabajo empleamos ensayos de gen reportero en peces cebra (Danio rerio) transgénicos para determinar si los RBFOX1-HARs son capaces de actuar como enhancers transcripcionales y comparamos su actividad con sus secuencias ortólogas de chimpancé. Con esta estrategia, descubrimos que 15 de los 19 RBFOX1-HARs son enhancers activos en peces cebra y que 10 de estas regiones regulatorias exhiben una expresión diferencial en comparación con sus ortólogas de chimpancé. Por otra parte, empleamos un enfoque de edición génica en ratones mediante CRISPR/Cas9 para eliminar, de manera independiente, dos HARs que resultaron de interés, y establecer el impacto funcional in vivo de cada deleción. Mediante RT-qPCR observamos un aumento en la expresión de Rbfox1 a los 14.5 días embrionarios en el mesencéfalo en los ratones Rbfox1Δ2xHAR.321/Δ2xHAR.321 y a los 8 días postnatales en la corteza cerebral en los ratones Rbfox1Δ2xHAR.505/Δ2xHAR.505. La secuenciación del ARNm reveló que un alto número de genes diferencialmente expresados en los ratones mutantes son genes regulados por Rbfox1. En cambio, casi no hubo cambios en el splicing alternativo, probablemente debido a una redundancia en las funciones de las proteínas de la familia Rbfox. Nuestros hallazgos agregan a RBFOX1 a la selecta lista de genes del neurodesarrollo que experimentaron evolución acelerada en el linaje humano con consecuencias en sus redes regulatorias de la expresión génica. Nuestro trabajo representa un paso más para llenar la brecha que existe entre los cambios genéticos humano-específicos y sus consecuencias fenotípicas.

Abstract:

A long-standing goal of evolutionary biology has been to decode how changes in gene regulatory networks contribute to human-specific traits. Identifying such changes and establishing their biological impact is a major challenge, mainly due to difficulties predicting the function of non-coding sequences. However, recent comparative studies have begun to reveal potential genetic drivers underlying human biological features, among which Human Accelerated Regions (HARs) stand out. These elements are highly conserved in most mammalian species but show a significant excess of human-specific sequence changes. The high degree of conservation of HARs suggests that HARs are subject to functional constraints, while the increased rate of substitutions in humans could indicate the acquisition of a differential function in our species. Numerous HARs have been shown to act as transcriptional enhancers during embryonic neurodevelopment, and some show changes in spatiotemporal expression compared to their orthologs sequences. Despite these advances, the contribution of HARs in gene regulation in vivo remains poorly understood. In our laboratory we have determined that one of the locus of the human genome that accumulates a large number of HARs is the one occupied by the RNA Binding Protein, fox-1 homolog (RBFOX1) gene, a trans-acting factor that regulates alternative splicing mainly in neuronal cells, skeletal muscle, and heart. Besides, its dysfunction has been associated with various neurodevelopmental disorders. Here we employed transgenic reporter assays in zebrafish (Danio rerio) to determine if the RBFOX1-HARs are transcriptional enhancers and compare their activity with their chimpanzee orthologous sequences. With this approach, we uncovered that 15 out of 19 RBFOX1-HARs are active enhancers in zebrafish and that 10 of these regulatory regions exhibit differential expression compared to their chimpanzee orthologs. Furthermore, we employed a genetic engineering approach in mice by CRISPR/Cas9 to independently remove two HARs of interest, and to establish the in vivo functional impact of each deletion. Using RT-qPCR, we found an increase in the expression of Rbfox1 at 14.5 embryonic days in the midbrain in Rbfox1^(Δ2xHAR.321/Δ2xHAR.321) mice and at 8 postnatal days in the cerebral cortex in Rbfox1^(Δ2xHAR.505/Δ2xHAR.505) mice. RNA sequencing revealed that a high number of differentially expressed genes in the knockout mice are genes regulated by Rbfox1. In contrast, there were almost no changes in alternative splicing, probably due to a redundancy in the functions of the Rbfox family proteins. Taken together, our findings adds RBFOX1 to the limited list of genes involved in brain development that underwent accelerated evolution in the human lineage affecting its gene regulatory networks. Our work represents one step further to fill the gap between human-specific genetic changes and their phenotypic consequences.

Citación:

---------- APA ----------

Berasain, Lara. (2023). Análisis de la regulación transcripcional del gen RBFOX1 desde un enfoque evolutivo. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7326_Berasain

---------- CHICAGO ----------

Berasain, Lara. "Análisis de la regulación transcripcional del gen RBFOX1 desde un enfoque evolutivo". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2023.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7326_Berasain

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