Efecto de Rab11a en la regulación de la secreción activada por calcio en células cromafines de la médula adrenal

Alfonso Bueno, Samuel Alberto

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Efecto de Rab11a en la regulación de la secreción activada por calcio en células cromafines de la médula adrenal
Título alternativo:	Effect of Rab11a in the regulation of calcium–activated secretion in chromaffin cells of the adrenal medulla
Autor:	Alfonso Bueno, Samuel Alberto
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias (IFIBYNE)
Fecha de defensa:	2023-04-19
Fecha en portada:	19 de abril de 2023
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Departamento Docente:	Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Director:	Marengo, Fernando Diego; Gallo, Luciana Inés
Jurado:	Colman Lerner, Alejandro Ariel; Tomes, Claudia Nora; Raingo, Jesica
Idioma:	Español
Palabras clave:	EXOCITOSIS; RAB11A; TRAFICO VESICULAR; FUSION VESICULAREXOCYTOSIS; RAB11A; VESICULAR TRAFFCKING; VESICULAR FUSION
Formato:	PDF
Handle:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7301_AlfonsoBueno
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7301_AlfonsoBueno.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7301_AlfonsoBueno
Ubicación:	BIO 007301
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Alfonso Bueno, Samuel Alberto. (2023). Efecto de Rab11a en la regulación de la secreción activada por calcio en células cromafines de la médula adrenal. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7301_AlfonsoBueno

Resumen:

Rab11a es una proteína GTPasa pequeña de la familia de las Rab GTPasas que regula el tráfico de membrana en las vías de reciclado constitutivo, pero poco se sabe acerca de su rol en las vías secretorias de células neuroendocrinas. Por lo tanto, en este trabajo de Tesis estudiamos el posible rol de Rab11a en la secreción activada por calcio (Ca2+) de células cromafines murinas. Para esto transfectamos tres variantes distintas de Rab11a: Rab11aWT, su forma wild type (WT); Rab11aS25N, su mutante dominante negativa (S25N); y Rab11aQ70L, su mutante constitutivamente activa (Q70L). La exocitosis regulada por Ca2+ se estudió registrando los cambios en la capacitancia de membrana a través de la técnica de patch–clamp en configuración whole–cell. La sobreexpresión de cada variante de Rab11a redujo la exocitosis en respuesta a pulsos despolarizantes individuales o a trenes de 10 pulsos respecto al Control, mientras que las corrientes de Ca2+ no se vieron afectadas. Para evaluar el efecto de las diferentes variantes de Rab11a sobre una exocitosis masiva que involucre la movilización de vesículas del pool de reserva, medimos los cambios de capacitancia de membrana en respuesta a la diálisis de las células con una solución 1.5 μM de Ca2+ libre, una condición independiente de la activación de los canales de Ca2+ de la membrana. Consistentemente, la velocidad máxima del aumento de la capacitancia y la magnitud de la exocitosis disminuyó para ambas mutantes. Dado que Rab11a ha sido implicada en el tráfico de membrana de vesículas salientes del Golgi hacia la membrana plasmática a través de su interacción con motores moleculares, evaluamos si la sobreexpresión de las variantes de Rab11a afecta la disponibilidad de las vesículas secretoras a la membrana. Por lo tanto, estudiamos la distribución de estas vesículas utilizando microscopía confocal. Para ello, cotransfectamos el neuropéptido Y (NPY), usado como marcador vesicular, con cada una de las variantes de Rab11a (WT, S25N y Q70L), y observamos: (i) una disminución en la cantidad de vesículas marcadas con NPY que se ubican en la periferia celular, un efecto que se acentúa con la mutación S25N y se mantiene cuando las células fueron estimuladas con alto K+ (50 mM); (ii) un aumento en la acumulación perinuclear de NPY que colocaliza con GFP–GalT, usado como marcador de Golgi; (iii) una disminución en la translocación a la periferia celular de vesículas secretoras jóvenes, determinadas por el temporizador fluorescente mKGO–NPY. En general, estos experimentos indican que Rab11a estaría implicada en la provisión de vesículas secretoras hacia la región de liberación en la membrana plasmática, posiblemente regulando la biogénesis de las vesículas secretoras, el transporte a la membrana plasmática y/o la maduración de las vesículas. Finalmente, con el fin de estudiar posibles efectos de Rab11a sobre los eventos que ocurren río abajo en la vía secretoria se evaluó la dinámica de fusión vesicular registrando la liberación de adrenalina en tiempo real, a través de la técnica de amperometría. Encontramos que la sobreexpresión de la mutante Q70L redujo la amplitud, pero aumentó significativamente los tiempos al pico, medio y de decaimiento de las espigas amperométricas, provocando un enlentecimiento en la liberación del contenido vesicular. Este efecto podría estar generado por un poro de fusión restringido que enlentece la liberación de las catecolaminas desde la vesícula. Es sabido que la tensión generada por la actina cortical favorece la apertura del poro de fusión de la vesícula con la membrana. Por medio de microscopía confocal, determinamos que Q70L redujo considerablemente la marca asociada a rodamina–faloidina, un marcador de la F–actina, en la región cortical de la célula, lo cual es coherente con la hipótesis planteada. Concluimos que Rab11a regula la disponibilidad y la cinética de fusión de vesículas secretoras en las células cromafines.

Abstract:

The small GTPase Rab11a is a well–known coordinator of membrane traffic in constitutive recycling pathways. Little is known about its role in the secretory pathways of neuroendocrine cells. Therefore, to fill this gap, we studied Rab11a’s role in the regulated secretion using murine chromaffin cells, a well–known cellular system for neurosecretion. We transfected fluorescently–tagged Rab11a wild type (WT), dominant negative Rab11aS25N mutant (S25N) or constitutively active Rab11aQ70L mutant (Q70L) in chromaffin cells. Regulated secretion was studied by electrophysiology, registering real–time capacitance changes with the patch–clamp technique in whole–cell configuration. Rab11a overexpression (either WT. S25N, or Q20L0) reduced the exocytosis upon individual or train depolarization stimuli, while calcium currents were not significantly affected. We evaluated capacitance changes after dialyzing 1.5 μM free calcium, which generates massive exocytosis with mobilization of vesicles from the reserve pools, independently of an effect on calcium channels. In these conditions, maximum velocity and the magnitude of exocytosis were reduced for both mutants. Since Rab11a has been implicated in membrane trafficking of post–Golgi vesicles to the plasma membrane through its interaction with molecular motors, we evaluated if the overexpression of Rab11a variants could be affecting secretory vesicles availability at the membrane. Therefore, we studied the distribution of these vesicles using confocal microscopy. We cotransfected fluorescently–tagged neuropeptide Y (NPY), as a marker for regulated secretory vesicles, with each of Rab11a variants (WT, S25N, and Q70L), and we observed: (i) a reduction in the number of NPY–tagged vesicles at the cell periphery, an effect that is accentuated with S25N mutation and was also observed with cells stimulated with high K+ (50 mM); (ii) an increase in the perinuclear accumulation of NPY that colocalizes with GFP–GalT as a Golgi marker; (iii) a decrease in the translocation of young secretory vesicles to the cell periphery, when we used mKGO–NPY as a fluorescent timer. In general, these experiments show that Rab11a coordinates the supply of secretory vesicles at the plasma membrane, by regulating vesicular biogenesis, maturation and/or transport to the plasma membrane. Finally, to study the effects of Rab11a on downstream events in the secretory pathway, we evaluated vesicular fusion dynamics by recording the release of adrenaline in real time through amperometry. We found that overexpression of Rab11a–Q70L significantly reduced the amplitude and increased the time to peak, half–width time and decay time of the amperometric spikes, when compared to control, generating a delay in the release of vesicular content. Knowing that cortical actin generates tension that favors the opening of the fusion pores of the vesicles with the membrane, we evaluated F–actin distribution at the periphery of the cell. By confocal microscopy, we determined that Q70L reduced the signal associated with cortical F–actin, evaluated with phalloidin–rhodamine. We conclude that Rab11a regulates secretory exocytosis by modulating the availability and fusion kinetics of secretory vesicles in chromaffin cells.

Citación:

---------- APA ----------

Alfonso Bueno, Samuel Alberto. (2023). Efecto de Rab11a en la regulación de la secreción activada por calcio en células cromafines de la médula adrenal. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7301_AlfonsoBueno

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Alfonso Bueno, Samuel Alberto. "Efecto de Rab11a en la regulación de la secreción activada por calcio en células cromafines de la médula adrenal". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2023.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7301_AlfonsoBueno

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