Estudio mecanístico y diseño de fármacos asistido por computadora contra el virus del dengue

Adler, Natalia Sol

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Estudio mecanístico y diseño de fármacos asistido por computadora contra el virus del dengue
Título alternativo:	Mechanistic study and computer-aided drug design against dengue virus
Autor:	Adler, Natalia Sol
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	CONICET. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman" (CIBION)
Publicación en la Web:	2023-05-09
Fecha de defensa:	2023-02-27
Fecha en portada:	27 de febrero de 2023
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Inorgánica, Química Analítica y Química Física
Director:	Cavasotto, Claudio Norberto
Director Asistente:	Bollini, Mariela
Consejero:	Scherlis, Damián A.
Jurado:	Zeida Camacho, Ari F.; Capdevila, Daiana A.; Martini, María F.
Idioma:	Español
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7276_Adler
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7276_Adler.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7276_Adler
Ubicación:	Dep.QUI 007276
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Adler, Natalia Sol. (2023). Estudio mecanístico y diseño de fármacos asistido por computadora contra el virus del dengue. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7276_Adler

Resumen:

El dengue es la enfermedad viral transmitida por artrópodos de mayor incidencia a nivel mundial, alcanzando valores aproximados de 390 millones de casos al año. Actualmente, no existen vacunas ni terapias antivirales efectivas para el tratamiento de la infección, por lo que la necesidad del desarrollo de las mismas resulta imperiosa. De esta forma, el objetivo del presente trabajo fue identificar pequeñas moléculas que puedan presentar actividad antiviral contra el virus del dengue mediante el diseño racional guiado por computadora, eligiéndose como blancos terapéuticos a la glicoproteína de envoltura (E) y el dominio helicasa de la proteína no estructural número 3 (NS3h). La glicoproteína E es una proteína de fusión de clase II que se encuentra formando dímeros sobre la superficie de la partícula viral. Esta proteína resulta esencial para el proceso de unión a receptor de la célula huésped y fusión de membranas para internalización de la partícula viral y liberación del material genético, resultando un blanco atractivo para el desarrollo de antivirales. Su estructura cristalina revela la existencia de un bolsillo hidrofóbico ocupado por el detergente n-octil-β-glucósido (β-OG), región que actúa a modo de bisagra entre los dominios I y II de la proteína y tiene un rol fundamental en los cambios conformacionales que tienen lugar durante el proceso fusión. De esta forma, fue propuesto que moléculas pequeñas capaces de unirse al sitio β-OG podrían inhibir la entrada del virus a la célula. Así, se procedió a la generación de moléculas candidatas a través de la estrategia de diseño de novo seguida de optimización de compuestos líderes guiada por computadora, haciendo uso de simulaciones de dinámica molecular clásica. Los compuestos seleccionados fueron sintetizados y posteriormente evaluados en su capacidad de inhibir la entrada del virus a la célula por los grupos de las Dras. Cybele García y Andrea Gamarnik. Se obtuvieron finalmente cuatro compuestos con actividad anti-DENV2 submicromolar. NS3 es una proteína multifuncional indispensable para el proceso de replicación viral, implicada en los procesos de replicación genómica, encapsidación, evasión de la respuesta inmune y procesamiento de la poliproteína viral. Posee dos dominios funcionales que se encuentran unidos por un linker flexible: en la región N-terminal presenta actividad serín proteasa que actúa en el clivaje de la poliproteína viral, mientras que la región C terminal cuenta con actividad helicasa, nucleósido 5’-trifosfatasa (NTPasa), RNA trifos-fatasa y de RNA annealing. Se ha demostrado que mutaciones en el dominio helicasa que conducen a la pérdida de actividad afectan directamente la supervivencia viral, convirtiéndola también en un blanco atractivo para el desarrollo de fármacos. Sin embargo, los inhibidores competitivos que se unen a los sitios activos de este tipo de enzimas suelen presentar problemas de especificidad. De esta forma, se plante ́o como objetivo generar moléculas pequeñas capaces de inhibir alostéricamente la actividad de NS3h. En una primera instancia se procedió al estudio mecanístico de la enzima, a fin de conocer mejor su funcionamiento y detectar posibles sitios de unión a ligando que permitieran la modulación alostérica de la actividad. Se estudió puntualmente el mecanismo de salida de productos de hidrólisis de ATP del sitio catalítico. Para esto se emplearon dos enfoques independientes: por un lado, se realizó un estudio de la cinética de estado estacionario de hidrólisis de ATP en presencia de productos, llevada a cabo por el grupo del Dr. Sergio Kaufman, y, por otro, cálculos computacionales de perfiles de energía libre asociados a la salida de fosfato (Pi) y ADP, empleando simulaciones de dinámica molecular guiada. Los resultados obtenidos fueron consistentes con un mecanismo de salida ordenado donde el Pi es el primero en ser liberado, seguido por ADP y, por su parte, los perfiles de energía libre generados sugirieron además un rol fundamental de una conformación abierta novedosa de la proteína en la salida de productos. Luego, mediante el uso de programas de búsqueda de hot spots se encontró un bolsillo que disminuía su volumen al pasar de la forma cerrada a la abierta de la proteína. Se postuló entonces que la unión de una molécula pequeña en ese sitio impediría que el mismo se compacte e influiría sobre la dinámica del cambio conformacional proteico, afectando el mecanismo de salida de productos e inhibiendo la actividad ATPasa de la enzima. De esta forma, se llevó a cabo un screening virtual en el sitio propuesto, empleando cuatro programas de docking distintos y combinando los resultados obtenidos mediante técnicas consenso. Se realizaron a continuación simulaciones de dinámica clásica sobre los compuestos que presentaron mejores valores de puntaje consenso y los compuestos más promisorios fueron adquiridos para evaluar su capacidad inhibitoria de la actividad ATPasa de NS3h in vitro. Contrario a lo esperado, ningún compuesto seleccionado mostró inhibición de la actividad pero en dos casos se observó un aumento de la misma. Se postuló entonces la posibilidad de que la unión de estas moléculas al dominio 3 pudiera tener un impacto negativo sobre la estabilidad de la conformación cerrada, sustentada por un aumento de la movilidad proteica observado en las simulaciones realizadas. Será necesario llevar adelante nuevos experimentos para validar esta hipótesis pero, en caso de confirmarse, podría aportar información valiosa sobre el funcionamiento de la enzima a la hora del diseño racional de inhibidores alostéricos.

Abstract:

Dengue fever is a mosquito-borne viral disease that has become a major public health concern worldwide, reaching approximate values of 390 million cases of infection per year. Currently, neither an approved drug nor an effective vaccine are available to fight the disease, so multiple efforts are being made by both industry and academia to develop anti dengue virus agents. Thus, the main goal of this thesis is to identify small molecules that could act as antiviral agents against dengue virus through computer-aided rational drug design. The chosen molecular targets to this end were the envelope protein (E) and the helicase domain of the non structural protein 3 (NS3h). The envelope glycoprotein E is a class II fusion protein that exists as dimers on the sur- face of mature virions. This protein plays a key role during the viral entry process, since it binds to host cell receptors and induces membranes fusion to allow internalization of the viral particle, constituting an attractive target for the development of antiviral drugs. The crystal structure of the E protein reveals the existence of a hydrophobic pocket occupied by the detergent n-octyl-β-d-glucoside (β-OG). This pocket lies at the hinge region between domains I and II and is important for the low pH-triggered conformational rearrangement required for the fusion of the virion with the host’s cell. Therefore, it was proposed that small molecules capable of binding to the β-OG pocket might inhibit virus entry. Candidate molecules that would bind this pocket were then generated employing a de novo design approach followed by computer-aided leader optimization through molecular dynamics simulations. The selected compounds were synthesized and subsequently evaluated for their ability to inhibit dengue virus entry into the host cell by Drs. Cybele Garcia and Andrea Gamarnik’s groups. Four compounds were found to be potent antiviral compounds in the low-micromolar range. NS3 is a multifunctional viral protein that is critical in the dengue virus life cycle, specifically implicated in viral replication, encapsidation, host immune evasion, and processing of the polyprotein precursor. The N-terminal region of NS3 is characterized as a serine protease, whereas the C-terminal region is classified as an RNA helicase, which also has NTPase, RTPase and RNA annealing activities. Mutations in the helicase domain that lead to loss of activity correlated directly with lack of virus replication, making NS3h also an attractive target for antiviral research. Helicases are nevertheless challenging drug targets because potent inhibitors are often not specific. Thus, we focused in identifying molecules that could act as allosteric NS3h inhibitors. As a first step, a mechanistic study of the enzime was performed to better understand its functioning and detect possible ligand-binding sites that would allow allosteric modulation of its activity. In particular, the product release mechanism of the catalytic cycle of ATP hydrolysis was analyzed. This study was based on a combined experimental and computational approach of product-inhibition studies, carried out by Dr. Sergio Kaufman’s group, and free energy calculations through steered molecular dynamics simulations. The results obtained support a model in which the catalytic cycle of ATP hydrolysis proceeds through an ordered sequential mechanism that includes a ternary complex intermediate (NS3h-Pi-ADP), which evolves releasing the first product, phosphate (Pi), and subsequently ADP. The results also indicate that in the product release stage a novel open-loop conformation of NS3h plays an important role. Then, employing hot spots prediction programs, a new pocket was found that reduces its volume when changing from the closed conformation of the protein to the open form. Thus, it was proposed that the union of a small molecule to this site would interfere with its volume reduction and affect NS3h conformational change dynamics, disrupting product release mechanism and inhibiting ATPase activity. Therefore, a virtual screening campaign was performed in this pocket employing four different docking softwares and combining the results through consensus techniques. Classical molecular dynamics simulations were then performed to the top molecules and the most promising compounds were acquired to evaluate their capacity to inhibit in vitro NS3h ATPase activity. Contrary to expectations, no selected compound showed inhibition of enzymatic activity but in two cases an increase was observed. It was then postulated that the binding of these molecules to domain 3 could have a negative impact on the stability of the closed conformation, supported by an increase in protein mobility observed in the simulations performed. It will be necessary to carry out new experiments to validate this hypothesis but, if confirmed, it could provide valuable information on the functioning of the enzyme when it comes to the rational design of allosteric inhibitors.

Citación:

---------- APA ----------

Adler, Natalia Sol. (2023). Estudio mecanístico y diseño de fármacos asistido por computadora contra el virus del dengue. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7276_Adler

---------- CHICAGO ----------

Adler, Natalia Sol. "Estudio mecanístico y diseño de fármacos asistido por computadora contra el virus del dengue". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2023.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7276_Adler

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