Registro:
Documento: | Tesis Doctoral |
Título: | Diseño, desarrollo y caracterización bioquímica y funcional de nanoanticuerpos VHH monovalentes dirigidos contra las proteínas del virus de influenza tipo A H1N1 y H3N2 |
Título alternativo: | Design, development and biochemical and functional characterization of monovalent nanoantibodies against subtypes H1N1 and H3N2 of type A influenza viruses |
Autor: | Sosa Holt, Carla Solange |
Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
Filiación: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Investigación Virología
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Publicación en la Web: | 2023-11-09 |
Fecha de defensa: | 2022-10-17 |
Fecha en portada: | 2022 |
Grado Obtenido: | Doctorado |
Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
Director: | Puntel, Mariana |
Consejero: | Scolaro, Luis Alberto |
Jurado: | Ibáñez, Lorena Itatí; Bratanich, Ana C.; Mongini, Claudia |
Idioma: | Español |
Formato: | PDF |
Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7210_SosaHolt |
PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7210_SosaHolt.pdf |
Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7210_SosaHolt |
Ubicación: | Dep.QUI 007210 |
Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Sosa Holt, Carla Solange. (2022). Diseño, desarrollo y caracterización bioquímica y funcional de nanoanticuerpos VHH monovalentes dirigidos contra las proteínas del virus de influenza tipo A H1N1 y H3N2. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7210_SosaHolt |
Resumen:
El virus de la Influenza tipo A continúa siendo responsable de brotes y epidemias, además de pandemias con graves consecuencias para la salud humana. Los virus tipo H1N1 y H3N2 están establecidos en la población humana como virus estacionales, representando los subtipos prevalentes. La hemaglutinina (HA) es el antígeno inmunodominante que contiene en su dominio globular (HA1) el sitio de unión al receptor celular (RBS) que induce anticuerpos neutralizantes asociados con la protección contra la infección. En el presente trabajo se caracterizaron nanoanticuerpos (VHHs) derivados de llama inmune específicos para el virus de la Influenza tipo A, con el fin de investigar su potencial como herramienta terapéutica. Se seleccionaron 10 VHHs específicos contra H1N1. Dos VHHs (B33 y D81) mostraron unión específica contra los subtipos H1, H5 y H3, que reconocieron epítopes lineales. B33 se unió cerca del N-terminal del tallo de HA (HA2) y D81 se unió cerca del C-terminal de HA1. Debido a su amplio rango de reconocimiento, los VHH B33 y D81 podrían considerarse candidatos para complementar herramientas de diagnóstico. Cinco VHH neutralizantes (A5, D81, D91, E13 y G41) reconocieron epítopes ubicados en HA1. E13 y G41 reconocieron epítopes conformacionales en HA1, y mostraron capacidad neutralizante contra otros 6 virus de origen humano, aviar y porcino, aislados entre los años 1934 y 2018. Este último dato sugiriere que el epítope involucrado en el reconocimiento sería altamente conservado, requisito necesario para la elección de una herramienta terapéutica de aplicación universal. En el modelo ratón, VHH E13 mostró efecto profiláctico esterilizante contra los virus H1N1 (hu/Arg/09, hu/Arg/09 ma, y hu/PR8/34) en todo el rango de dosis administradas (5 mg/kg a 0,05 mg/kg), y no fue posible detectar virus en los pulmones de los animales tratados el día 4 después de la exposición. Por otro lado, G41 mostró un efecto profiláctico específico frente a la cepa hu/Arg/09 (dosis 5 mg/kg) y una protección parcial frente a la misma adaptada al ratón y frente al hu/PR8/34, logrando en el 100% de los animales el mantenimiento del peso a lo largo del ensayo. Se destaca la capacidad de E13 para controlar la infección por H1N1 en ratones, respaldando su desarrollo como un inmuno-terapéutico para la profilaxis y el tratamiento del virus Influenza. Por otro lado, se encontraron eficacias profilácticas similares para los VHHs E13 y G41 expresados en P. Pastoris, lo cual evidencia la factibilidad de la elaboración de estos VHHs en un sistema de expresión frecuentemente utilizado por la industria farmacéutica. A su vez, se detectó una respuesta inmune humoral disminuida en los animales que reciben tratamiento específico con E13, o con G41, sugiriendo que la inmunidad pasiva desata un menor compromiso de la respuesta inmune endógena en los individuos tratados. Adicionalmente, no se observó una respuesta específica contra los VHHs suministrados lo que agrega un dato de seguridad de los VHHs terapéuticos. Por otro lado, a través de un biopaneo se realizó la búsqueda de nanoanticuerpos específicos contra el virus H3N2 hu/Perth/09. De los 26 clones obtenidos fue posible obtener 8 clones para su futura caracterización. A su vez, en el presente estudio se presenta el trabajo de la puesta a punto del modelo cobayo de infección con virus influenza, el cual no requiere de la adaptación de los virus de origen humano, con potencial aplicación a la eficacia tanto terapéutica como profiláctica de los VHHs, como así también el estudio del bloqueo de la transmisión viral por contacto. De los resultados anteriores se desprende que la administración local de los VHHs neutralizantes, E13 y G41 otorga protección total frente a la infección viral con virus influenza H1N1, y respalda su desarrollo posterior como componente activo de inmunoterapéuticos y su transferencia a la clínica médica.
Abstract:
The Influenza A virus is responsible for outbreaks and epidemics, as well as pandemics with serious consequences for human health. The H1N1 and H3N2 virus appeared in the human population as seasonal viruses, and both have represented the prevalent subtypes. Hemagglutinin (HA) is the major immunodominant protein which contains in its globular domain (HA1) the cell receptor binding site (RBS) that induces neutralizing antibodies associated with protection against infection. In the present work, llama-derived nanobodies (VHH) specific for Influenza A virus were characterized in order to investigate their potential as a therapeutic tool. Ten H1N1-specific VHHs were selected. Two VHHs (B33 and D81) showed specific binding against subtypes H1, H5 and H3, which recognized linear epitopes. The nanobody B33 bound near the N-terminus of the HA stem (HA2) while D81 bound near the C-terminus of HA1. Due to their wide recognition range, the VHHs B33 and D81 could be considered candidates for diagnostic tools. Five neutralizing VHHs (A5, D81, D91, E13 and G41) recognized epitopes located on HA1. E13 and G41 recognized conformational epitopes on HA1 and showed neutralizing capacity against 6 other viruses of human, avian and porcine origin, isolated between 1934 and 2018. This last data suggests that the epitope involved in the recognition would be highly conserved, a necessary requirement for a therapeutic tool potentially applicable globally. In the mouse model, E13 showed a sterilizing prophylactic effect against H1N1 viruses (hu/Arg/09, hu/Arg/09 ma, and hu/PR8/34) throughout the range of administered doses (5 mg/kg to 0,05 mg/kg), and no virus was detectable in the lungs of treated animals on day 4 post-challenge. On the other hand, G41 showed a specific prophylactic effect against the hu/Arg/09 strain (dose 5 mg/kg) and partial protection against it adapted to mice and against hu/PR8/34, with no significant weight loss throughout the trial. Therefore, it is highlighted the ability of E13 to control H1N1 infection in mice, supporting its development as an immunotherapeutic for prophylaxis and treatment for influenza virus infection. Similar prophylactic efficacies were found for VHHs E13 and G41 expressed in P. pastoris, an expression system frequently used by the pharmaceutical industry. In addition, a reduced humoral immune response was detected for the animals treated with E13, or with G41, demonstrating that passive immunity unleashes a lower commitment of the endogenous immune response in the treated individuals. Furthermore, no specific response against the supplied VHHs was observed, which adds a safety data of the therapeutic uses of the VHHs. Furthermore, after the selection of VHHs against H3N2 hu/Perth/09 virus 26 clones were obtained, and 8 clones are available for future characterization. In addition, this work presents the development of the guinea pig model of influenza virus infection, which does not require the adaptation of viruses of human origin, with potential application to both therapeutic and prophylactic efficacy of VHHs, as well as the setup of the guinea pig model for future application to the study of the blocking of viral transmission by contact. The above results, would suggest that the local administration of the neutralizing VHH, E13 gives total protection against viral infection with most H1N1 influenza viruses, and supports their subsequent development as an active component of immunotherapeutics and their translation to the clinical setting.
Citación:
---------- APA ----------
Sosa Holt, Carla Solange. (2022). Diseño, desarrollo y caracterización bioquímica y funcional de nanoanticuerpos VHH monovalentes dirigidos contra las proteínas del virus de influenza tipo A H1N1 y H3N2. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7210_SosaHolt
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Sosa Holt, Carla Solange. "Diseño, desarrollo y caracterización bioquímica y funcional de nanoanticuerpos VHH monovalentes dirigidos contra las proteínas del virus de influenza tipo A H1N1 y H3N2". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2022.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7210_SosaHolt
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