Actividad de la región regulatoria del gen shavenbaby durante el desarrollo de la mosca Drosophila melanogaster

Ortiz, Daniela María

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Actividad de la región regulatoria del gen shavenbaby durante el desarrollo de la mosca Drosophila melanogaster
Título alternativo:	Function of the cis-regulatory region of the shavenbaby gene during Drosophila melanogaster development
Autor:	Ortiz, Daniela María
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Lugar de trabajo:	Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias (IFIBYNE)
Publicación en la Web:	2022-12-29
Fecha de defensa:	2022-11-10
Fecha en portada:	10 de noviembre del 2022
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Departamento Docente:	Departamento de Ecología, Genética y Evolución
Director:	Frankel, Nicolás
Consejero:	Fanara, Juan José
Idioma:	Español
Palabras clave:	DROSOPHILA; ADN REGULATORIO; ENHANCERS; SHAVENBABY; PLEIOTROPIA; REDUNDANCIA; RED DE REGULACION GENETICADROSOPHILA; REGULATORY DNA; ENHANCERS; SHAVENBABY; PLEIOTROPY; REDUNDANCY; GENE REGULATORY NETWORK
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7209_Ortiz
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7209_Ortiz.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7209_Ortiz
Ubicación:	BIO 007209
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Ortiz, Daniela María. (2022). Actividad de la región regulatoria del gen shavenbaby durante el desarrollo de la mosca Drosophila melanogaster. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7209_Ortiz

Resumen:

La activación de las redes de regulación genética (RRGs) conduce a procesos de diferenciación celular, proliferación, apoptosis y homeostasis durante el desarrollo. Muchos de los genes dentro de las RRGs poseen regiones regulatorias de la transcripción con una arquitectura genética compleja. Dentro de las regiones regulatorias existen distintos tipos de elementos regulatorios, siendo los enhancers los elementos más profundamente estudiados. Los enhancers contienen la información necesaria para establecer dónde, cuándo y cuánto seexpresa un gen. En esta tesis estudiamos la estructura y función de la región regulatoria de la transcripción del gen shavenbaby (svb) de Drosophila melanogaster. Este gen se expresa en las células epidérmicas y promueve la formación de estructuras no sensoriales con forma de pelo (llamadas tricomas) en la cutícula. Al sintetizarse, Svb se comporta como un represor transcripcional (Svb-REP) y luego de un proceso de degradación de su extremo aminoterminal se convierte en un activador transcripcional (Svb-ACT). Svb-ACT activa la expresión de los genes efectores, los cuales ejecutan la formación de los tricomas en la cutícula. El patrón de expresión embrionario de svb es generado por siete enhancers que están localizados en una región de 90 kilobases ubicada río arriba del sitio de inicio de la transcripción del gen. Además del embrión, svb se expresa en las células epidérmicas de lapupa/adulto, que producen los tricomas de la cabeza, tórax, abdomen, patas y alas. Sabemos que los siete enhancers embrionarios también están activos en la epidermis de la pupa. Análisis de conservación de secuencia en la región regulatoria de svb sugieren que existen más enhancers con actividad en pupa, además de los ya conocidos. Con el objeto de determinar cuántos enhancers están activos durante el estadio pupal y cómo están distribuidos dentro de la región regulatoria de svb, llevamos a cabo experimentos que nos permitieron comprender como funciona la región regulatoria de svb en la pupa. En primer lugar, realizamos una caracterización del patrón de expresión de svb en la epidermis de la pupa. Encontramos que svb comienza a expresarse en la epidermis abdominal de la pupa a las 35 hrs. después de la formación del pupario (APF) y que a partir de las 40 hrs. APF se convierte en un activador transcripcional (Svb-ACT). Una vez que definimos la dinámicatemporal de expresión y actividad de svb/Svb en el abdomen de la pupa, decidimos estudiarla regulación transcripcional de svb en ese contexto. Analizamos la apertura de la cromatina (con la técnica ATAC-seq) y la presencia de la marca epigenética H3K27ac (con la técnica CUT&RUN) y realizamos ensayos funcionales con construcciones reporteras. Encontramos siete enhancers nuevos de svb activos en la epidermis pupa. Estos enhancers se suman a los siete enhancers embrionarios, que también presentan actividad en ese estadio del desarrollo.Al analizar el paisaje regulatorio del locus svb en la pupa, observamos que los 14 fragmentos con actividad enhancer cubren prácticamente toda la región en cis de svb. Esta arquitectura regulatoria es diferente a la epidermis del embrión, en donde la expresión de svbes generada por 7 enhancers discretos dispersos en las 90 kb de la región regulatoria del gen. Luego, nos propusimos determinar posibles genes blanco de Svb en la epidermis abdominal de la pupa. Nuestro objetivo era determinar si dichos genes son los mismos que son activados por Svb en la epidermis embrionaria. Realizamos un ensayo de RNA-seq y obtuvimos una lista de genes con diferentes niveles expresión en la epidermis abdominal de la pupa. Encontramos que aproximadamente el 93% de los genes blanco de Svb validados en el embrión están también expresados en la epidermis abdominal de la pupa. En esta tesis analizamos la regulación transcripcional de un gen durante el desarrollo de D.melanogaster. Nuestros resultados aportan a la comprensión de la arquitectura genética de las regiones regulatorias de la transcripción de genes pleiotrópicos.

Abstract:

Gene regulatory networks (GRNs) control cell differentiation, proliferation, apoptosis and homeostasis during development. The genes that govern GRNs often have regulatory regions with a complex architecture. Different types of non-coding regulatory elements are found within regulatory, enhancers being the most widely studied elements. Enhancers determine where, when and how much a gene is expressed. In this thesis we focused on the architecture and function of the regulatory region of the shavenbaby (svb) gene in Drosophila melanogaster. This gene is expressed in epidermal cells of the fly, where it is necessary for the formation of non-sensory hair-like structures (named trichomes), which decorate the cuticle of the fly. When synthesized, Svb behaves as a transcriptional repressor (Svb-REP), and after a controlled degradation of its amino terminal end, Svb becomes a transcriptional activator (Svb-ACT). Svb-ACT activates the expression of several effector genes, which execute the formation of trichomes. The embryonic expression pattern of svb is generated by seven enhancers that are located in a region of 90 kilobases, upstream of the transcription start site of the gene. Svb is also expressed in the pupal epidermis, where it is required for trichome development of the wing, notum, abdomen and leg. So far, we know that the seven embryonic enhancers also regulate svb in the pupal epidermis. Sequence conservation analyses suggest that the regulatory region of svb harbors more enhancers not identified up to date, which could be active in the pupa. In order to identify svb enhancers that are active during the pupal stage, we carried out several experiments in the pupa. First, we studied the expression pattern of svb in the pupal epidermis. We found that the expression of svb in the pupal abdomen starts at 35 hrs. after puparium formation (APF) and that Svb becomes a transcriptional activator (Svb-ACT) from 40 hrs. APF onwards. Having defined the temporal dynamics of svb/Svb expression and activity in the pupal abdomen, we decided to study its transcriptional regulation. To that end, we analyzed the chromatin structure (with ATAC-seq and CUT&RUN) of the svb locus and performed functional assays with reporter constructs. We found seven novel enhancers of svb active in pupa (these enhancers add to the seven embryonic enhancers which are also active in pupa). When analyzing the regulatory landscape of svb in the pupa, we observed that 14 fragments with enhancer activity cover almost the entire cis region of svb. In contrast, the regulatory landscape of svb in the embryo is quite different; 7 discrete enhancers, scattered over the regulatory region, activate the gene. Then, we set out to identify possible target genes of Svb in the abdominal epidermis of the pupa. We wanted to determine if these genes are the same ones that are activated by Svb in the embryonic epidermis. We performed an RNA-seq assay and obtained a list of genes with different expression levels in the abdominal epidermis of the pupa. We uncovered that approximately 93% of Svb target genes in the embryo are also expressed in the pupal abdomen. In this thesis we analyzed the transcriptional regulation of a single gene during D. melanogaster development. Our results shed light on the architecture of regulatory regions of genes that are deployed multiple times during development.

Citación:

---------- APA ----------

Ortiz, Daniela María. (2022). Actividad de la región regulatoria del gen shavenbaby durante el desarrollo de la mosca Drosophila melanogaster. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7209_Ortiz

---------- CHICAGO ----------

Ortiz, Daniela María. "Actividad de la región regulatoria del gen shavenbaby durante el desarrollo de la mosca Drosophila melanogaster". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2022.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7209_Ortiz

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