Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Participación de la conjugación de SUMO en la biogénesis de los ARN pequeños nucleares |
| Título alternativo: | Involvement of SUMO conjugation in small nuclear RNA biogenesis |
| Autor: | Bragado, Laureano Fabián Tomás |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias (IFIBYNE)
|
| Publicación en la Web: | 2022-11-29 |
| Fecha de defensa: | 2022-03-18 |
| Fecha en portada: | 2022 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Director: | Srebrow, Anabella |
| Consejero: | Kornblihtt, Alberto Rodolfo |
| Jurado: | Boccaccio, Graciela Lidia; Manavella, Pablo; Silberstein, Susana |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES; CONJUGACION DE SUMO; snRNAs; COMPLEJO INTEGRATOR; INTS11; COMPLEJO SNAPc; SNAPC1POSTTRANSLATIONAL MODIFICATIONS; SUMO CONJUGATION; snRNAs; INTEGRATOR COMPLEX; INTS11; SNAP COMPLEX; SNAPC1 |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7191_Bragado |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7191_Bragado.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7191_Bragado |
| Ubicación: | Dep.BIO 007191 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Bragado, Laureano Fabián Tomás. (2022). Participación de la conjugación de SUMO en la biogénesis de los ARN pequeños nucleares. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7191_Bragado |
Resumen:
Los ARN pequeños nucleares (snRNAS) son moléculas de ARN no codificantes, de menos de 350 nucleótidos, ricos en uracilos, que se asocian con un gran conjunto de proteínas formando ribonucleopartículas pequeñas nucleares conocidas como “snRNPs”. Las funciones biológicas de los snRNAs están bien caracterizadas desde hace años. Los snRNAs U1, U2, U4, U5 y U6 forman las partículas snRNPs que llevan el mismo nombre y que se ensamblan para dar lugar al spliceosoma “mayor”, mientras que U11, U12, U4 atac, U6 atac juntos con U5 participan de la conformación del spliceosoma “menor” o minoritario. Por su parte, el snRNA U7 es requerido para el procesamiento de los pre-ARNm que codifican para las histonas no replicativas y el U3 es necesario para el procesamiento del ARN ribosomal. El snRNA 7SK es responsable de regular los niveles activos de p-TEFb, un complejo quinasa responsable de fosforilar a la ARN polimerasa II. La ARN polimerasa III es la responsable de transcribir a U6, U6 atac y 7SK, mientras que la ARN polimerasa II transcribe los restantes snRNAs. Teniendo en cuenta la relevancia de los snRNAs para la formación del spliceosoma y consecuentemente para el proceso de splicing, que la regulación de la expresión de estos ARNs no codificantes es aún escasamente comprendida, así como también trabajos previos de nuestro laboratorio que demostraron la importancia de la conjugación de SUMO (o “SUMOilación”) para el ensamblado y actividad catalítica del spliceosoma, decidimos explorar una posible conexión entre la maquinaria de SUMO y la biogénesis de los snRNAs transcriptos por la ARN polimerasa II. Hemos hallado que disminuir la SUMOilación global en células en cultivo, mediante la sobre-expresión de distintas SUMO proteasas, altera los niveles de snRNAs nacientes (no procesados). Además, pudimos identificar que diversas proteínas que forman parte de los complejos reguladores de las diferentes etapas de la biogénesis de los snRNAs son blanco de conjugación de SUMO. Nos enfocamos en dos de estas proteínas: SNAPC1, un factor de transcripción específico de snRNAs que pertenece al complejo SNAPc; y la proteína INTS11, subunidad responsable del procesamiento 3’ de los snRNAs nacientes dentro del complejo Integrator. En el caso de SNAPC1, observamos que al mutar las lisinas 245 y 333 disminuye drásticamente su conjugación a SUMO y esta proteína mutante deficiente de SUMOilación (SNAPC1 K245/333R) es incapaz de activar la transcripción de U1 y U2, a pesar de no tener alterado su reclutamiento a los promotores correspondientes. Esto indicaría que la SUMOilación de SNAPC1 es necesaria para que pueda ensamblarse el complejo SNAPc o bien para que este complejo reclute a los factores generales de la transcripción. Además, observamos que en ciertas líneas celulares en cultivo, la sobre expresión de dicha mutante lleva a la muerte celular. Esto podría deberse a alguna tolerancia diferencial a las alteraciones en los niveles de snRNAs. En el caso de INTS11, mediante mutagénesis dirigida pudimos determinar que las lisinas 381, 462 y 475 son blancos de conjugación de SUMO. Observamos que una versión triple mutante de esta proteína, INTS11 K381/462/475R o “3KR”, es incapaz de clivar transcriptos nacientes de snRNAs, a diferencia de la versión salvaje. Además, INTS11 3KR tiene alterada su interacción con algunas subunidades del complejo Integrator, pero no con aquellas que conforman el módulo catalítico (INTS4/INTS9/INTS11). Estos resultados sugieren que la SUMOilacion de INTS11 no participa en el ensamblado del módulo catalítico, pero es necesaria para la conformación de todo el complejo Integrator. Por otro lado, encontramos que INTS11 3KR presenta una localización sub-celular más citoplasmática que la versión salvaje. Se ha postulado al complejo Integrator como un complejo modular que se va ensamblado en forma co-transcripcional. Nuestros resultados nos llevan a proponer que el módulo catalítico se encuentra pre-ensamblado y que podría hallarse como tal en el citoplasma. Los resultados presentados muestran la relevancia de la SUMOilacion en la biogénesis de los snRNAs, tanto en el inicio de la transcripción como en el procesamiento 3’ de dichos transcriptos.
Abstract:
Small nuclear RNAs (snRNAS) are non-coding RNA molecules of less than 350 nucleotides, rich in uracil, which associate with a large set of proteins giving rise to small nuclear ribonucleoparticles known as “snRNPs”. The biological functions of snRNAs have been well characterized. The snRNAs U1, U2, U4, U5 and U6 form the snRNPs that are recognized by the same name, and which composed the major spliceosome; while U11, U12, U4 atac, U6 atac together with U5 participate in the conformation of the minor spliceosome. U7 snRNA is required for the processing of pre-mRNAs that encode non-replicative histones and U3 is necessary for ribosomal RNA processing. 7SK snRNA is responsible for regulating the activity of p-TEFb, a kinase complex responsible for phosphorylating RNA polymerase II. RNA polymerase III is responsible for transcribing U6, U6 atac and 7SK, whereas RNA polymerase II transcribes the remaining snRNAs. Taking into account the relevance of snRNAs for spliceosome composition and function and consequently for the splicing process, that the regulation of the expression of these non-coding RNAs is still poorly understood, together with previous work from our laboratory that demonstrated the importance of SUMO conjugation (or "SUMOylation") for spliceosome assembly and catalytic activity, we decided to explore a possible connection between the SUMO machinery and the biogenesis of snRNAs, in particular those transcribed by RNA polymerase II. We have found that decreasing global SUMOylation in cultured cells, through the overexpression of different SUMO proteases, alters the levels of nascent (unprocessed) snRNAs. Furthermore, we have identified a variety of proteins that are part of the regulatory complexes of the different stages of snRNA biogenesis as bonafide SUMO conjugation targets. We focused on two of these proteins: SNAPC1, a specific snRNA transcription factor that belongs to the SNAPc complex; and the INTS11 protein, the subunit responsible for the 3' endonucleolytic cleavage of nascent snRNAs within the Integrator complex. In the case of SNAPC1, we have observed that mutating lysine residues 245 and 333 drastically reduced SUMO conjugation to this protein. This obtained SUMOylation-deficient mutant (SNAPC1 K245/333R) is unable to activate the transcription of U1 and U2, despite the fact it is still recruited to the corresponding promoters. This would indicate that SUMOylation of SNAPC1 is required for SNAPc complex assembly or for this complex to recruit general transcription factors. Furthermore, we have observed that in certain mammalian cell lines, the overexpression of this mutant leads to cell death. This could be due to a differential sensitivity to alterations in snRNA levels. In the case of INTS11, through site-directed mutagenesis we have determined that lysine residues 381, 462 and 475 are SUMO conjugation sites within this protein. We observed that a triple mutant version, INTS11 K381 / 462 / 475R (“3KR"), is unable to cleave nascent snRNA transcripts, unlike the wild type version. Furthermore, INTS11 3KR displays a diminished interaction with certain subunits of the Integrator complex, but not with those that compose the catalytic core (INTS4 / INTS9 / INTS11). These results suggest that INTS11 SUMOylation is not involved in the assembly of the Integrator catalytic core but is necessary for the conformation of the entire complex. On the other hand, we have found that INTS11 3KR displays a more cytoplasmic sub- cellular localization than the wild type version. The Integrator complex has been postulated as a modular complex that is assembled in a co-transcriptional manner. Our results lead us to suggest that the catalytic module is independently pre-assembled and that it could be found as such in the cytoplasm. The results presented in this thesis uncover the relevance of SUMOylation for snRNA biogenesis, both for transcription initiation as well as for 3’ end processing of these transcripts.
Citación:
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Bragado, Laureano Fabián Tomás. (2022). Participación de la conjugación de SUMO en la biogénesis de los ARN pequeños nucleares. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7191_Bragado
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Bragado, Laureano Fabián Tomás. "Participación de la conjugación de SUMO en la biogénesis de los ARN pequeños nucleares". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2022.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7191_Bragado
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