Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Multiplicación clonal de gametas, aplicada a la generación de embriones bovinos |
| Título alternativo: | Gamete genome cloning, used in bovine embryo production |
| Autor: | Suvá, Mariana |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Publicación en la Web: | 2022-11-29 |
| Fecha de defensa: | 2020-05-05 |
| Fecha en portada: | 2019 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Director: | Salamone, Daniel Felipe |
| Consejero: | Vissio, Paula Gabriela |
| Jurado: | Cebral, Elisa; Tríbulo, Paula; Buffone, Mariano G. |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | CLONACION; ANDROGENESIS; PARTENOGENESIS; HEMICLONESCLONING ; ANDROGENETIC ; PARTHENOGENETIC; HEMICLONES |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7170_Suva |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7170_Suva.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7170_Suva |
| Ubicación: | Dep.BIO 007170 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Suvá, Mariana. (2020). Multiplicación clonal de gametas, aplicada a la generación de embriones bovinos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7170_Suva |
Resumen:
La producción de embriones androgénicos haploides (EAh) y embriones partenogénicos haploides (EPh) presenta un gran potencial en el ámbito de la producción animal y la medicina. Dado que las blastómeras de un EPh o EAh contienen copias exactas del ADN de la gameta que lo originó, representan clones del genoma de ese oocito o espermatozoide. Esto permite, por un lado, multiplicar el rendimiento reproductivo de dicha gameta (resultando en la producción de hemiclones), pero también realizar análisis genéticos pre-cigóticos (antes de generar el cigoto). Sin embargo, la generación de embriones haploides aún presenta algunas dificultades, especialmente en animales de producción. En el caso de los EAh, los protocolos descriptos son técnicamente complejos. Por otro lado, la activación haploide, necesaria para obtener EPh y durante la producción de embriones heteroparentales, es ineficiente en el bovino. Por lo tanto, en esta tesis se trabajó en primer lugar sobre diferentes estrategias para la producción de EAh mediada por FIV. Los resultados obtenidos siguieren que al realizar FIV de oocitos enucleados, el porcentaje de polispermia intrínseco de la técnica y la variabilidad característica de cada toro generaría una incertidumbre respecto al porcentaje real de embriones haploides que se obtendrían. Por el contrario, al realizar la enucleación posterior a un protocolo de FIV corta (4 horas) se observó que es posible identificar a cada genoma durante la micromanipulación, resolviendo de esta manera el obstáculo que representa en bovinos poder diferenciar el origen parental de los pronúcleos (PN). Por otro lado, se evaluó la producción de EAh mediante micromanipulación sin zona pelúcida (ZP), que resultó en un procedimiento más simple, tasas de desarrollo a blastocisto similares a la micromanipulación tradicional con ZP, pero mejores tasas de clivaje. El análisis cromosómico de los EAh de día 2 junto con el análisis genético de marcadores moleculares de los blastocistos sugiere que los estadíos tempranos representan una mejor fuente de blastómeras para producir hemiclones, ya que una mayor proporción de ellas aún mantiene el complemento haploide. A continuación, se evaluaron diferentes protocolos de activación haploide que potencialmente reemplacen a Io-3h-DMAP para ser aplicados en: a) la producción de EPh, y b) durante la producción de hemiclones. Para ello, se comparó la eficiencia de activación partenogénica haploide de los agentes activadores etanol (Et), roscovitina (Rosc), cicloheximida (CHX), dehidroleucodina (DhL) y PD0325901 (PD), luego de un tratamiento con Ionomicina (Io). A continuación, estos agentes fueron combinados en tratamientos novedosos. Los resultados mostraron que Rosc y CHX son similares respecto a la formación de PN, extrusión del segundo corpúsculo polar (2CP) y clivaje. Sin embargo, teniendo presente el objetivo de reemplazar el uso de drogas de amplio espectro por otras con blancos más específicos, Rosc se presenta como una mejor alternativa. Por otro lado, a pesar de que los tratamientos combinados incrementaron la formación de PN, el tratamiento simple con Rosc presentó una tendencia a inducir las mayores tasas de embriones haploides según el recuento cromosómico realizado a día 2 del desarrollo. Por lo tanto, se sugiere utilizar el protocolo Io-Rosc para la producción de EPh. A su vez, se decidió utilizar este tratamiento para activar a los hemiclones. Finalmente, se trabajó sobre la producción de embriones heteroparentales a partir de la fusión de un oocito con una blastómera androgénica haploide ya que, según reportes previos, se caracterizan por un desarrollo menor respecto a los controles. Por lo tanto, en primer lugar confirmó que la activación con Io-Rosc resultara en tasas de desarrollo similares a las descriptas anteriormente en bovinos. Luego, se trabajó sobre la sincronización entre la célula donante y el citoplasto receptor. Se comparó el efecto sobre el desarrollo embrionario de la fusión de la blastómera con un oocito pre-activado (grupo AFA) respecto al protocolo de activación posterior a la fusión (grupo FA). El grupo AFA resultó en menores tasas de desarrollo embrionario respecto al grupo FA, aunque la diferencia no resultó significativa. Sin embargo, su potencial estaría comprometido desde etapas más tempranas. Ambos grupos resultaron en un desarrollo menor que el control por lo que, mediante el análisis de marcadores moleculares, se descartó que se debiera una falla en la incorporación del ADN de la blastómera androgénica. Se realizaron ensayos preliminares de sincronización de células en metafase, que sugieren que el tratamiento de las blastómeras haploides con nocodazol seguido por MG132 podría resultar en mayores tasas de desarrollo de embriones heteroparentales. Finalmente, se analizó la abundancia relativa de ARNm de genes de interés en embriones tempranos y blastocistos. Los hemiclones en estadío temprano presentaron un patrón de expresión alterado, que sería consecuencia de la activación artificial y no de características intrínsecas del embrión. En contraste, la expresión de los blastocistos FA fue comparable a los controles FIV. En conclusión, aún no resulta claro el motivo del menor potencial de desarrollo de los hemiclones, aunque resulta evidente que es un fenómeno biológico presente en todas las especies estudiadas hasta el momento. Sin embargo, las modificaciones en los protocolos desarrolladas en esta tesis simplifican notablemente la técnica, lo que vuelve al bovino una especie modelo para estudio de EAh, EPh y hemiclones, y abre nuevas puertas en esta rama de la biotecnología.
Abstract:
The production of androgenetic haploid embryos (AHE) and parthenogenetic haploid embryos (PHE) holds great potential for animal breeding and medicine. The nuclei of the blastomeres from these haploid embryos contain exact copies of the gamete ́s DNA, so they can be considered clones from that sperm cell or oocyte, enhancing its reproductive performance. Moreover, this technique enables pre-zygotic genetic sceening. However, the production of haploid embryos still has some difficulties, particularly in farm animals. On one hand, protocols to obtain AHE are still difficult and inefficient, even though different strategies have been evaluated. On the other hand, to produce PHE haploid activation of mature oocytes should be induced, and no reliable protocols have been described in bovine. Proper haploid activation is also a key step to trigger embryo development after biparental reconstruction using a mature oocyte and an androgenetic haploid blastomere. Moreover, biparental embryos show a low developmental potential even though their genetic constitution is based on a maternal and a paternal genome. Therefore, in this work we first evaluated different strategies to obtain AHE using IVF. Results suggest that fertilization of enucleated oocytes would lead to an uncertainty about the real proportion of AHE obtained, as a consequence of the polispermic fertilizations that are usually obtained after IVF and natural differences between bulls. On the contrary, results show that enucleation of zygotes produced by a short IVF (4 hours) enables the direct observation and differenciation of the parental genomes during micromanipulation. Next, enucleation of zygotes with zona pelucida (ZP; EAh-ZP) and without the zona pelucida (ZF; EAh-ZF) was compared. Blastocyst rates were similar between groups. However, enucleation ZF was easier and faster, and EAh-ZF showed higher cleavage rates and quality of day 2 embryos, based on the number of cells. Chromosome count of day 2 EAh-ZF and molecular markers of blastocysts suggest that to produce biparental embryos and ensure euploidy, early AHE should be selected as donors of paternal genome. Next, different haploid activation protocols were evaluated to replace Io-3h-DMAP, aiming to: a) improve the efficiency of PHE production, and b) activate biparental embryos. Parthenogenetic haploid activation was evaluated after Ionomycin (Io) treatment followed by ethanol (Et), roscovitine (Rosc), cycloheximide (CHX), dehydroleucodine (DhL) and PD0325901. These agents were then combined in novel protocols. Results show that Rosc and CHX were equally efficient to induce pronuclear (PN) formation, second polar body (2PB) extrusion and cleavage. However, new protocols go towards the use of drugs with specific targets instead of broad spectrum inhibitors. In this context, Rosc might be a better alternative. Additionally, even though combined treatments after Io increased PN formation, Io-Rosc tended to induce the highest rates of haploid day 2 embryos. Therefore, results suggest that Io-Rosc is a better activation protocol to produce PHE and to activate biparental embryos. Finally, we worked on biparental embryo production by fusion of an oocyte with an androgenetic haploid blastomere. Previous reports show that these embryos have a lower developmental potential than controls. First, we confirmed no detrimental effect on development of the haploid activation protocol Io-Rosc. Next, the effect of cell synchronization between the blastomere and the recipient oocyte was evaluated. We analysed whether fusion of an androgenetic blastomere with a pre-activated oocyte (group AFA; activation-fusion-activation) improves embryo development compared with fusion with a mature oocyte (group FA; fusion-activation). A lower blastocyst rate was obtained in group AFA, but the difference was not significant. However, developmental potential appears to be compromised from earlier stages in this group. Both FA and AFA groups resulted in lower blastocyst rates than the diploid parthenogenetic control. Using molecular markers we confirmed that the lower development is not the consequence of a lack of paternal genome. Preliminary results on cell synchronization at metaphase stage suggest that treatment of the androgenetic haploid blastomeres before fusion with nocodazole followed by MG132 might improve developmental rates of biparental embryos. Finally, we analysed mRNA abundance of selected genes in early embryos and blastocysts. Results showed an altered gene expression in biparental early embryos that appears to be the consequence of the parthenogenetic activation and is not related with the biparental embryo per se. In contrast, gene expression in blastocyst was similar to parthenogenetic and IVF controls. In conclusion, the reason for the lower development to the blastocyst stage of the biparental embryos is still not clear. However, in this work improved and simpler protocols for de production of AHE, PHE and biparental embryos are presented. This makes bovine a suitable model to continue research on the field and explore different applications of this biotechnology.
Citación:
---------- APA ----------
Suvá, Mariana. (2020). Multiplicación clonal de gametas, aplicada a la generación de embriones bovinos. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7170_Suva
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Suvá, Mariana. "Multiplicación clonal de gametas, aplicada a la generación de embriones bovinos". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2020.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7170_Suva
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