Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Endocitosis dependiente e independiente de dinamina asociadas a la exocitosis de pool vesículas inmediatamente liberable en células cromafines de la médula adrenal |
| Título alternativo: | Dynamin-dependent and -independent endocytosis associated with the exocytosis of an immediately releasable pool of vesicles in chromaffin cells of the adrenal medulla |
| Autor: | Bayonés, Lucas |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias (IFIBYNE)
|
| Publicación en la Web: | 2022-12-29 |
| Fecha de defensa: | 2021-03-19 |
| Fecha en portada: | Marzo del 2021 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Marengo, Fernando Diego |
| Director Asistente: | Cárdenas, Ana María |
| Consejero: | Szczupak, Lidia |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | IRP; DINAMINA; A618T; S619L; EXOCITOSIS; ENDOCITOSIS; F-ACTINAIRP; A618T; S619L; EXOCYTOSIS; ENDOCYTOSIS; F-ACTIN |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7152_Bayones |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7152_Bayones.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7152_Bayones |
| Ubicación: | BIO 007152 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Bayonés, Lucas. (2021). Endocitosis dependiente e independiente de dinamina asociadas a la exocitosis de pool vesículas inmediatamente liberable en células cromafines de la médula adrenal. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7152_Bayones |
Resumen:
EI IRP (por Immediately Releasable Pool), es un grupo de vesículas secretorias cuya exocitosis está altamente acoplada al estímulo debido a su estrecha asociación con canales de Ca²+ voltaje dependientes (CCVD). Sabemos por resultados previos, que entre un 40 y un 50% de IRP es exocitado por la aplicación de un potencial de acción (PAs), y que dicha exocitosis es seguida por una endocitosis rápida dinamina-dependiente totalmente compensatoria, ligada a un proceso rápido de recuperación de este pool vesicular. Por otro lado, la exocitosis completa de IRP (inducida por un pulso cuadrado de voltaje de 50 ms), es seguida también por un proceso endocítico que solamente compensa un 50% de la exocitosis previa, pero no sabemos nada acerca del mecanismo subyacente. En una primera parte de este trabajo de tesis nos propusimos estudiar la participación de la GTPasa dinamina en la endocitosis, al liberar gradualmente IRP en células cromafines murinas. Para ello, estimulamos con un protocolo compuesto por pulsos despolarizantes de duración creciente: PAS (5 ms) y pulsos cuadrados (SQPS) de 5, 10, 25, y 50 ms (SQP5-50ms). Nuestros resultados mostraron que si bien la dinamina es esencial en la endocitosis evocada por PAs, a medida que la fracción exocitada aumenta, este proceso se vuelve insensible a diferentes inhibidores de la actividad de esta proteína. Esto indica que al liberar completamente IRP se activa un proceso endocítico dinamina-independiente. Observamos, además, que la velocidad de esta endocitosis independiente de dinamina se correlaciona con la entrada de Ca²+, estimada como la integral debajo de la curva de corriente de Ca2+. Por otro lado, la aplicación de distintos inhibidores de la proteína quinasa C (PKC) disminuyeron la magnitud y la velocidad de la endocitosis dinamina-independiente, y el tratamiento con PMA (un activador de PKC) aumentó significativamente la amplitud de este proceso endocítico. Por lo tanto concluimos que dicha endocitosis dinamina-independiente es un proceso Ca2+ dependiente regulado por PKC. En la segunda parte de la Tesis, evaluamos el efecto de dos mutaciones de la dinamina-2, A618T y S619L, relacionadas con el desarrollo de la miopatía centronuclear, cuyos efectos sobre la exocitosis y endocitosis en células cromafines son desconocidos. La expresión de estas mutantes no modificó la exocitosis de IRP para ninguno de los estímulos evaluados. Sin embargo, inhibió significativamente a la endocitosis evocada por PAs, sin afectar a aquella provocada por SQP50ms, lo cual es coherente con la predominancia de la endocitosis dinamino-dependiente en el primer tipo de estímulo. Finalmente, estímulos más potentes, que exocitan cantidades de vesículas marcadamente mayores que IRP, promueven una endocitosis lenta identificada previamente por otros autores como un mecanismo clatrina dependiente, que es a su vez dependiente de dinamina. Coherentemente, este proceso resultó muy sensible a ambas mutantes. Por otro lado, la exocitosis de cantidades grandes de vesículas, inducida por pulsos despolarizantes prolongados o la aplicación del agonista nicotínico DMPP por 10 s, resultó inhibida significativamente en presencia de A618T y S619L. Este resultado, sumado a la falta de efecto que se observó previamente para estímulos de corta duración, sugiere que estas mutantes podrían estar alterando la provisión de vesículas a la membrana. De hecho, al analizar la distribución de vesículas secretorias por medio de microscopía confocal, observamos que la recuperación de las vesículas en las proximidades de la membrana plasmática, luego de un estímulo que induce exocitosis, se vio afectada negativamente en presencia de A618T y S619L. Llamativamente, se observó una marcada disminución en la formación de novo de F-actina cortical en células expresando las mutaciones, pero no en la condición control. Es esperable que esta disrupción en la formación de F-actina cortical tenga un efecto directo en el tráfico de vesículas a la membrana y, por lo tanto, en la recuperación de la población vesicular liberable y en la exocitosis inducida por estímulos potentes. Por otro lado, está demostrado que la F-actina participa en prácticamente todos los mecanismos de endocitosis conocidos. Por lo tanto, la alteración de la dinámica del citoesqueleto de F-actina cortical puede ser un denominador común a todos los efectos causados por A618T y S619L. Sin embargo, el mecanismo por el cual A618T y S619L producen este efecto sobre la F-actina, aun es una interrogante que queda por ser elucidada.
Abstract:
IRP (for Immediately Releasable Pool), is group of secretory vesicles whose exocytosis is highly coupled to stimuli due to its tight association to voltage-dependent calcium channels (VDCC). Previous results from our lab showed that between 40 and 50% of IRP is exocyted by the application of an action potential-like stimuli (PAs), and that exocytosis is followed by a fast dynamin-dependent fully compensatory endocytosis, linked to a fast replenishment process of this vesicular pool. On the other hand, the complete exocytosis of IRP (induced by a 50 ms voltage squared pulse), is also followed by an endocytotic process that compensates only 50% of the previous exocytosis, however we do not know anything about its underlying mechanism. In the first part of this Thesis work we set to study the involvement of dynamin GTPase in the endocytosis evoked, when IRP was gradually depleted, in mouse chromaffin cells. For this, we applied a stimulation protocol compound by depolarizing pulses of crescent duration: PAs (5 ms) and squared pulses (SQPs) of 5, 10, 25 and 50 ms (SQP5-50ms). Our results showed that although dynamin is essential in the endocytosis evoked by PAs, as the exocyted fraction increases, the endocytotic process becomes insensitive to the application of different inhibitors of the activity of this GTPase. This indicates that, the fully release of IRP, activates a dynamin-independent endocytotic process. We also observed that the rate of this dynamin-independent endocytosis correlates with the influx of Ca²+, estimated as the integral of the values below the calcium currents curves. On the other hand, the application of different inhibitors of the protein kinase C (PKC). diminished the magnitude and rate of the dynamin-independent endocytosis, and the treatment with PMA (a PKC activator), significantly increased the amplitude of this endocytotic process. We therefore conclude that this dynamin-independent endocytosis is a Ca²+ dependent process, which is regulated by PKC. In the second part of this Thesis work, we evaluated the effect of two dynamin-2 mutations. A618T y S619L, related with the development of the centronuclear myopathy disease, whose effects over the exocytosis and endocytosis in chromaffin cells are unknown. The expression of these mutations did not modify the IRP exocytosis, for any of the stimuli applied. However, A618T and S619L significantly inhibited the evoked by PAs, but no for SQP50ms, which is coherent with the predominance of the dynamin-dependent endocytosis associated with the first stimulus. Finally, more potent stimuli, which exocyte larger amounts of vesicles than IRP, promote a slow endocytosis, previously identified by other authors as a clathrin-dependent mechanism, which is also dynamin-dependent. Coherently, this process resulted to be very sensitive to the expression of both mutations. On the other hand, the exocytosis of large amounts of vesicles, induced by prolonged depolarizing pulses or by the application of the nicotinic agonist DMPP for 10 s, was significantly inhibited in the presence of A618T and S619L. This result, in addition to the lack of effect observed previously when short stimuli duration was applied. suggest that this mutations could be altering the provision of vesicles to the plasma membrane. In fact, when we analyzed the distribution of secretory vesicles by confocal microscopy, we observed that the recovery of vesicles located nearby the plasma membrane, after a stimulation that induced exocytosis, was negatively affected in presence of A618T and S619L. Strikingly, a marked decrease in the novo formation of cortical F-actin was observed in cells expressing these mutations, but not in control cells. It is expected that this disruption, in the formation of cortical F actin, has a direct effect on vesicle trafficking to the plasma membrane and, therefore, in the recovery of the releasable vesicle population and exocytosis, induced by potent stimulation. On the other hand, it has been demonstrated that F-actin participates in practically all known endocytotic mechanisms. Therefore, the alteration of the cortical actin cytoskeleton dynamics could be a common denominator for all of the effects caused by A618T and $619L. However, the underlying mechanism by which A618T and S619L produced this effect over F-actin is a question that remains to be elucidated.
Citación:
---------- APA ----------
Bayonés, Lucas. (2021). Endocitosis dependiente e independiente de dinamina asociadas a la exocitosis de pool vesículas inmediatamente liberable en células cromafines de la médula adrenal. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7152_Bayones
---------- CHICAGO ----------
Bayonés, Lucas. "Endocitosis dependiente e independiente de dinamina asociadas a la exocitosis de pool vesículas inmediatamente liberable en células cromafines de la médula adrenal". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2021.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7152_Bayones
Estadísticas:
Descargas totales desde :
Descargas mensuales
https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7152_Bayones.pdf
