Registro:
Documento: | Tesis Doctoral |
Título: | Mecanismos moleculares de acción del sistema CRH/CRHR1 : activación de la vía de Akt en un contexto neuronal |
Título alternativo: | Molecular mechanisms downstream CRH/CRHR1 system : Akt pathway activation in a neuronal context |
Autor: | dos Santos Claro, Paula Ayelén |
Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
Lugar de trabajo: | Instituto Max Planck Argentina - CONICET. Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires - Instituto Partner de la Sociedad Max Planck (IBIOBA-MPSP)
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Publicación en la Web: | 2023-05-09 |
Fecha de defensa: | 2022-04-22 |
Fecha en portada: | 2022 |
Grado Obtenido: | Doctorado |
Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
Director: | Silberstein Cuña, Susana Iris |
Consejero: | Srebrow, Anabella |
Jurado: | Blaustein Kappelmacher, Matías; Biondi, Ricardo M.; Novaro, Virginia |
Idioma: | Español |
Palabras clave: | SISTEMA DE CRH; Akt; MAPKs; AMPc; GPCR; ENDOCITOSIS; TRANSDUCCION DE SEÑALES; TRANSITO DE GPCRSCRH; Akt; MAPKs; cAMP; GPCR; ENDOCYTOSIS; SIGNAL TRANSDUCTION; GPCR TRAFFICKING |
Formato: | PDF |
Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7102_DosSantosClaro |
PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7102_DosSantosClaro.pdf |
Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7102_DosSantosClaro |
Ubicación: | BIO 007102 |
Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. dos Santos Claro, Paula Ayelén. (2022). Mecanismos moleculares de acción del sistema CRH/CRHR1 : activación de la vía de Akt en un contexto neuronal. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7102_DosSantosClaro |
Resumen:
La hormona liberadora de corticotropina (CRH) ejerce un rol central en la respuesta neuroendocrina y comportamental al estrés, dirigiendo la activación del eje hipotálamo- hipófisis-adrenal y actuando como neuromodulador en el sistema nervioso central. Su desregulación se relaciona con desórdenes psiquiátricos y con el inicio de procesos neurodegenerativos. Nuestro objetivo es definir las vías de señalización de CRH por el receptor CRHR1 y los componentes moleculares involucrados, con potencial relevancia terapéutica en desórdenes ligados a estrés. CRHR1 es un GPCR clase B que se encuentra generalmente acoplado a proteína Gs, por lo que su activación promueve el aumento intracelular del segundo mensajero AMP cíclico (AMPc) y la consecuente activación de diversas cascadas de señalización. Hasta el momento, la vía de las MAP quinasas (MAPKs) fue la más estudiada río abajo de este receptor. En trabajos previos hemos descripto que el CRHR1 activa mecanismos dependientes de proteína G y otros dependientes de la endocitosis, los cuales se evidencian en la activación bifásica de la MAPKs ERK1/2 en la línea celular hipocampal murina HT22 que expresa el receptor de CRH tipo 1 (HT22-CRHR1). Hemos demostrado además que existen dos fuentes de AMPc asociadas a la activación del CRHR1, que involucran no solo a las adenilil ciclasas transmembrana (tmACs) sino también a la adenilil ciclasa soluble (sAC). Ambas fuentes participan en la fase aguda de activación de ERK1/2 pero solo sAC es esencial para la activación sostenida de esta quinasa. Como se ha descripto recientemente para un grupo de GPCRs, el CRHR1 activado continúa señalizando luego de su internalización. Akt es una serin/treonin quinasa presente en la mayoría de los tejidos, cuya actividad media procesos celulares diversos como el crecimiento, la proliferación y el metabolismo. En el cerebro, la vía de Akt tiene implicancias en la respuesta a estrés, la neurotransmisión y la plasticidad sináptica. A su vez, se ha descripto que el efecto antidepresivo de numerosas drogas es mediado por la cascada de PI3K-Akt. En este trabajo nos propusimos evaluar si la vía de PI3K-Akt estaba involucrada en la señalización del sistema CRH/CRHR1 y si existía un crosstalk con la ya descripta cascada de MAPKs. En las HT22-CRHR1, Akt se fosforila en respuesta al estímulo de CRH y esta fosforilación es dependiente del pool de AMPc generado por la sAC. Sin embargo, esta activación no depende de los efectores clásicos de AMPc (PKA y EPACs) sino que parece estar mediada por la proteína quinasa Src. En base al estado de fosforilación de diversos sustratos pudimos determinar que el Akt fosforilado (pAkt) es funcional en estas células. El perfil de activación de Akt resultó ser opuesto al de ERK1/2 lo cual sugería una posible conexión entre estas vías. La inhibición farmacológica de MEK no tuvo efecto sobre la activación de Akt, mientras que inhibir tanto PI3K como Akt disminuyó los niveles de ERK1/2 fosforilado (pERK1/2) en respuesta a CRH. Por el contrario, la inhibición de la vía PI3K-Akt llevó a un aumento de la respuesta global de AMPc mediada por CRH y de CREB fosforilado (pCREB). Teniendo en cuenta que la activación de Akt solapa temporalmente con la segunda fase de activación de ERK1/2 que es dependiente de la endocitosis, evaluamos los niveles de pAkt en células en las que la internalización fue bloqueada. Determinamos que al igual que para ERK1/2, la endocitosis del CRHR1 es crucial para la fosforilación de Akt. Mediante el análisis de colocalizaciones entre el receptor y marcadores de distintos compartimentos de vesículas y organelas de membrana, exploramos la identidad de las estaciones por las que transita el CRHR1 luego de su internalización. CRHR1 activado se detecta en endosomas tempranos (Rab5+), de reciclado (Rab11+) y en un compartimento sintaxina-6 positivo. CRHR1 colocaliza además, con los efectores de Rab5 APPL1 y EEA1. En HT22-CRHR1 silenciadas establemente mediante el uso de shRNAs, la depleción de APPL1 disminuyó los niveles de pAkt sin afectar la fosforilación de ERK1/2 en respuesta a CRH, mientras que la pérdida de EEA1 tuvo el efecto contrario. Estos resultados indican que la vía de PI3K-Akt se activa río abajo del CRHR1 en un contexto neuronal y que existe un crosstalk entre Akt y ERK1/2. Por otra parte, el hecho de que la fosforilación de Akt sea dependiente de la internalización del receptor y de la proteína endosomal APPL1, refuerza la idea de que el CRHR1 activado señaliza desde compartimientos intracelulares.
Abstract:
Corticotrophin releasing hormone (CRH) plays a key role in the regulation of neuroendocrine, autonomic, and behavioral response to stress. In the central nervous system it drives hypothalamic-pituitary-adrenal axis activation and can act as a neuromodulator. Dysregulation of the CRH/CRHR1 system is crucial in the pathogenesis of disorders like anxiety and depression. Our aim is to characterize signaling pathways downstream CRH-activated CRHR1 with potential therapeutic value in stress-related disorders. CRHR1 is a class B GPCR that signals mainly by Gs coupling, leading to an increase of cyclic AMP (cAMP) and the activation of multiple signaling cascades. Up to date the MAPKs pathway has been the most studied downstream of this receptor. We have previously described that CRHR1 activates G protein-dependent and receptor endocytosis-dependent mechanisms evidenced as a biphasic ERK1/2 activation in the mouse hippocampal cell line HT22 stably expressing CRHR1 (HT22-CRHR1). We have shown that upon stimulation, CRHR1 engages separate cAMP sources, involving the soluble adenylyl cyclase (sAC) in addition to transmembrane adenylyl cyclases. Both sources participate in the acute activation of ERK1/2, but only sAC activity is essential for the sustained phospho-ERK1/2 (pERK1/2) phase. Moreover, we demonstrated that CRHR1 continues to generate cAMP from endocytic compartments, uncovering a link between sAC and endosome based GPCR signaling. Akt is a central serine/threonine kinase expressed in almost all cell types throughout the body which regulates several cellular processes such as cell growth, proliferation, and metabolism. In the brain, Akt pathway has significant functional impact on stress responses, neurotransmission, and synaptic plasticity. PI3K-Akt signaling has also been implicated in the etiology of mood disorders as well as in the antidepressant-like effects of various psychiatric drugs. In this work we wanted to assess whether the PI3K-Akt pathway was involved in CRH/CRHR1 signaling and if there was a crosstalk with the MAPKs cascade. In HT22-CRHR1 cells, Akt was phosphorylated downstream activated CRHR1 in a cAMP-dependent manner. However, this activation did not rely on classic cAMP effectors (PKA and EPACs) but seems to be mediated by Src kinase. Phosphorylated Akt (pAkt) was active as evidenced by the phosphorylation state of substrates. pAkt profile was opposite to that of pERK1/2 which suggested a possible crosstalk between these pathways. Inhibition of MEK had no effect on Akt activation, whilst pharmacological inhibition of either PI3K or Akt diminished pERK1/2 levels in response to CRH. On the contrary, PI3K-Akt inhibition appeared to increase CRH-mediated cAMP response and CREB phosphorylation. Given that Akt activation temporally overlapped with the endocytosis-dependent phase of ERK1/2 activation, we evaluated pAkt levels in cells where internalization had been blocked and found that CRHR1 endocytosis is indeed required for Akt phosphorylation. Next, we wanted to determine the identity of the endocytic compartments to which CRHR1 transits after internalization. Colocalization analysis between the receptor and several endocytic compartment markers showed that activated CRHR1 transits to early (Rab5+) and recycling (Rab11+) endosomes, as well as to a syntaxin-6 positive compartment. CRHR1 also colocalized with two Rab5 effectors, APPL1 and EEA1. APPL1 silencing by shRNAs lead to a decrease in pAkt levels without affecting ERK1/2 activation, whereas EEA1 depletion had the opposite effect. These results indicate that PI3K-Akt pathway is activated downstream CRHR1 in a neuronal context and that there is a crosstalk between Akt and ERK1/2. Moreover, Akt phosphorylation dependent on receptor internalization and endosomal APPL1, reinforces the idea of CRHR1 signaling from endosomes.
Citación:
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dos Santos Claro, Paula Ayelén. (2022). Mecanismos moleculares de acción del sistema CRH/CRHR1 : activación de la vía de Akt en un contexto neuronal. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7102_DosSantosClaro
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dos Santos Claro, Paula Ayelén. "Mecanismos moleculares de acción del sistema CRH/CRHR1 : activación de la vía de Akt en un contexto neuronal". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2022.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7102_DosSantosClaro
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