Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Enzimas microbianas activas sobre polisacáridos estructurales de pared celular vegetal : producción recombinante y caracterización bioquímica y funcional |
| Título alternativo: | Microbial enzymes active on plant cell wall polysaccharides : recombinant production and biochemical and functional characterization |
| Autor: | Garrido, Mercedes María |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria - CONICET. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular (IABIMO)
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| Publicación en la Web: | 2022-10-04 |
| Fecha de defensa: | 2022-04-26 |
| Fecha en portada: | 2022 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Campos, Eleonora; Wirth, Sonia Alejandra |
| Consejero: | Levin, Laura Noemí |
| Jurado: | Asención Diez, Matías; Saparrat, Mario C. N.; López, Nancy I. |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | ENZIMAS RECOMBINANTES; CELULOSA ; HEMICELULOSA; MICROORGANISMOS; CAZIMAS; BIOMASA LIGNOCELULOSICARECOMBINANT ENZYMES; CELLULOSE; HEMICELLULOSE; MICROORGANISMS; CAZYMES; LIGNOCELLULOSIC BIOMASS |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7084_Garrido |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7084_Garrido.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7084_Garrido |
| Ubicación: | BIO 007084 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Garrido, Mercedes María. (2022). Enzimas microbianas activas sobre polisacáridos estructurales de pared celular vegetal : producción recombinante y caracterización bioquímica y funcional. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7084_Garrido |
Resumen:
La biomasa lignocelulósica consiste principalmente en polisacáridos estructurales y es considerada una materia prima con gran potencial para la producción sustentable de biocombustibles y bioproductos. Sin embargo, la viabilidad económica de estos procesos depende de la conversión eficiente de los polisacáridos estructurales, celulosa y hemicelulosa, en oligosacáridos cortos y azúcares monoméricos fermentables (glucosa y xilosa). Para lograrlo es necesario desarrollar cócteles enzimáticos compuestos por múltiples enzimas activas sobre carbohidratos, o CAZimas, con actividades complementarias y que pueden provenir de distintos organismos lignocelulolíticos. Estas incluyen glicosil hidrolasas (GHs) y enzimas auxiliares con actividad oxidativa (Aas) que son clasificadas en familias según su secuencia de aminoácidos y estructura tridimensional. La hipótesis de esta Tesis es que las enzimas secretadas por hongos y bacterias celulolíticas aeróbicas tienen actividades complementarias que pueden resultar en sinergismo para la degradación de biomasa lignocelulósica residual. Su caracterización y producción en sistemas recombinantes permite su aplicación en procesos de bioconversión específica de polisacáridos estructurales a monómeros fermentables. El objetivo principal del presente trabajo es el clonado, expresión recombinante y caracterización bioquímica y funcional de CAZimas fúngicas y bacterianas para ser aplicadas en procesos de deconstrucción de biomasa lignocelulósica residual. Se seleccionaron enzimas de dos organismos altamente eficientes en la degradación de lignocelulosa: el hongo Pycnoporus sanguineus y la bacteria Cellulomonas sp. B6. Los hongos del género Pycnoporus son productores de extractos enzimáticos extracelulares con actividad ligno-celulolítica y se destacan por su eficiencia para la degradación de la pared celular vegetal, en especial de celulosa y lignina. Por otro lado, las bacterias del género Cellulomonas codifican para numerosas CAZimas extracelulares. En particular, el aislamiento Cellulomonas sp. B6 se caracteriza por su alta actividad xilanolítica extracelular. Por ello, este trabajo se enfoca en la caracterización de enzimas activas sobre celulosa de P. sanguineus y de xilano de Cellulomonas sp. B6. Entre las enzimas fúngicas se clonaron dos exoglucanasas o celobiohidrolasas I (CBH I) (EC 3.2.1.176), de la familia GH7 (PsCel7A y PsCel7B) y tres monooxigenasas líticas de polisacáridos (LPMO) (EC 1.14.99.54) de la familia AA9 (PsAA9A, PsAA9B y PsAA9C). Las celobiohidrolasas I son exoglucanasas que actúan procesivamente desde el extremo reductor de la celulosa cristalina liberando celobiosa y en los hongos se encuentran clasificadas como GH7. Son secretadas en gran abundancia por hongos celulolíticos y cumplen un rol fundamental en la deconstrucción de la biomasa, siendo componentes mayoritarios de los cócteles enzimáticos comerciales. Para la expresión de PsCel7A y PsCel7B se utilizó una plataforma de expresión semi-industrial basada en una cepa mutante ΔcbhI del hongo filamentoso Trichoderma reseei. Las enzimas se purificaron del sobrenadante de cultivo y se caracterizaron bioquímicamente. La actividad de ambas enzimas recombinantes purificadas sobre biomasa lignocelulósica (rastrojo de maíz), en combinación con endoglucanasas y β-glucosidasas comerciales, generó una conversión de glucanos a glucosa de aproximadamente 40%, lo cual es aproximadamente el 67% relativo a la actividad de la enzima de referencia comercial Cel7A de T. reesei. Esto indica un potencial para su uso ya que se utilizaron las condiciones de reacción óptimas de TrCel7A. Restan realizarse futuras optimizaciones de las condiciones de reacción para evaluar la eficiencia de PsCel7A y PsCel7B en bioprocesos. A su vez, para la deconstrucción de la fracción cristalina de la celulosa son necesarias enzimas auxiliares capaces de generar cortes en los enlaces glucosídicos de la celulosa cristalina, con un mecanismo oxidativo y en presencia de un dador de electrones, llamadas LPMOs y clasificadas en la familia AA9. La acción de estas enzimas facilitaría el acceso de las GHs a estas regiones altamente recalcitrantes de la celulosa, mejorando la eficiencia en la conversión de la biomasa. De las 16 AA9 codificadas en el genoma de P. sanguineus, se seleccionaron tres en base a estudios previos. Las enzimas recombinantes PsAA9A, PsAA9B y PsAA9C se expresaron utilizando la plataforma fúngica de la levadura Pichia pastoris. PsAA9A y PsAA9B se purificaron exitosamente desde el sobrenadante de cultivo mientras que PsAA9C se detectó en la fracción intracelular. La actividad de ambas enzimas se ensayó sobre sustratos celulósicos, aunque solo se detectó actividad para PsAA9A, por lo que se realizó su caracterización exhaustiva. PsAA9A, en presencia de un dador de electrones, genera cortes por oxidación en sustratos celulósicos, produciendo celo-oligosacáridos solubles, nativos y oxidados, de grado de polimerización entre 2 y 6. En ensayos de complementariedad con celulasas individuales se demostró el sinergismo para la degradación de celulosa con endoglucanasas (GH5), celobiohidrolasas II (extremos no reductores) (GH6) y β-glucosidasa (GH1), aunque no con celobiohidrolasas I (extremo reductor) (GH7). Esta falta de sinergismo podría deberse a un efecto inhibitorio generado por el ácido gálico, compuesto utilizado como dador de electrones en la reacción. Por ello, en el diseño de un cóctel enzimático que incluya LPMOs se deberán optimizar las proporciones para evitar la inhibición de las GH7. A su vez, Cellulomonas sp B6 secreta un amplio repertorio de enzimas activas sobre xilanos, en presencia de biomasa. Por ello, se estudiaron en esta Tesis dos enzimas desramificantes del xilano y su sinergismo con xilanasas, paso crítico para su aprovechamiento. La degradación eficiente de arabinoxilanos (AXs) y glucuronoxilanos (GXs) es de gran interés debido a que son los tipos predominantes de hemicelulosa en cereales y pasturas (AXs) y en maderas duras (GXs). Para ello, resulta clave la utilización de enzimas con actividad α–L-arabinofuranosidasa y α-glucuronidasa debido a que son capaces de hidrolizar sustituciones de arabinosa y ácido 4-O-metil D-glucurónico, respectivamente, y permiten un mejor acceso para otras enzimas con actividad sobre la cadena principal, como las β-1,4-endoxilanasas. Se estudiaron entonces una α–L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) de la familia GH62 (CsAbf62A) y una α–glucuronidasa (EC 3.2.1.139) de la familia GH67 (CsAgu67A) para clonar y expresar de manera recombinante en una plataforma bacteriana de Escherichia coli. Ambas enzimas se purificaron del citoplasma de células de E. coli recombinantes y se caracterizaron bioquímica y funcionalmente. Las familias GH62 y GH67 tienen hasta el momento 24 y 25 enzimas caracterizadas, respectivamente. CsAbf62A presentó actividad α–L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) sobre arabinoxilanos y arabino-xilo-oligosacáridos, hidrolizando específicamente las sustituciones simples de arabinosa unidas con enlaces α-1,2 o α-1,3 a los residuos de xilosa que forman el esqueleto del polisacárido, aunque no las sustituciones dobles. También se detectó la liberación de arabinosa a partir de las sustituciones del arabinano, otro polisacárido de la pared celular vegetal. CsAgu67A presentó actividad α-glucuronidasa (EC 3.2.1.139), removiendo sustituciones de ácido 4-O-metil D-glucurónico desde el extremo reductor de glucurono-xilo-oligosacáridos, pero no de sustituciones internas ni del polisacárido. Ambas enzimas se evaluaron en combinación con tres β-1,4-endoxilanasas (EC 3.2.1.8) de las familias GH10 (CsXyn10A y CsXyn10B) y GH11 (CsXyn11A), previamente expresadas en el laboratorio. En ensayos de degradación de biomasa residual, la eliminación de residuos de arabinosa por CsAbf62A mejoró la accesibilidad de la xilanasa CsXyn10A al AX de trigo, aumentando la concentración de xilobiosa liberada, en comparación a la actividad de CsXyn10A sola. Por otro lado, la liberación de xilosa a partir de GX de madera de haya por CsXyn10A y CsXyn10B aumentó significativamente en presencia de CsAgu67A y una β-1,4-xilosidasa comercial GH43. Los resultados obtenidos en esta Tesis permitieron tener un repertorio de actividades enzimáticas complementarias, necesarias para mejorar la eficiencia de degradación de los polisacáridos presentes en la biomasa lignocelulósica. La disponibilidad de estas enzimas permitirá el desarrollo de formulaciones óptimas de complejos enzimáticos, específicas para cada tipo de biomasa y proceso de aplicación. Así se sientan las bases para el diseño de cnsorcios enzimáticos “a medida”, para su aplicación en la producción de hexosas y pentosas y/o en la funcionalización de polisacáridos.
Abstract:
Lignocellulosic biomass is one of the most attractive raw materials for the production of biofuels and bioproducts. However, the economic viability of these processes depends on the efficient conversion of the structural polysaccharides, cellulose and hemicellulose, into short oligosaccharides and fermentable monomeric sugars (glucose and xylose). One of the most promising strategies involves the use of optimized carbohydrate-active enzyme (CAZymes) cocktails, with diverse complementary activities that may come from different lignocellulolytic organisms. These include enzymes of various families of glycosyl hydrolases (GHs) and oxidative enzymes with auxiliary activity (AAs) that are classified according to their amino acid sequence and three-dimensional structure. The main objective of the present work is the cloning, recombinant expression and biochemical and functional characterization of various fungal and bacterial CAZymes to be used in the deconstruction of residual lignocellulosic biomass. For this aim, we worked on the selection of CAZymes active on biomass from the saprophytic fungus Pycnoporus sanguineus and the cellulolytic bacterium Cellulomonas sp. B6, two highly efficient organisms in the degradation of lignocellulose. Fungi of the genus Pycnoporus produce extracellular enzymatic extracts with ligno- cellulolytic activity and stand out for their high degradation efficiency of all the components of the plant cell wall, especially cellulose and lignin. On the other hand, bacteria of the genus Cellulomonas code for numerous extracellular CAZymes. In particular, the isolate Cellulomonas sp. B6 is characterized by its high extracellular xylanolytic activity. Therefore, this work focuses on the characterization of enzymes active on cellulose of P. sanguineus and on hemicellulose of Cellulomonas sp. B6. As for fungal enzymes, two exoglucanases or cellobiohydrolases I (CBH I) (EC 3.2.1.176), of the GH7 family (PsCel7A and PsCel7B) and three lytic polysaccharide monooxygenases (LPMO) (EC 1.14.99.54) of the AA9 family (PsAA9A, PsAA9B and PsAA9C) were cloned. Cellobiohydrolases I are processive exo-glucanases that act from the reducing end of crystalline cellulose and release cellobiose. They are among the main enzymes secreted by cellulolytic fungi and play a fundamental role in the deconstruction of biomass, being the main components of commercial enzymatic cocktails. For the expression of PsCel7A and PsCel7B, a semi-industrial expression platform was tested using a mutant strain Δcel7A of the filamentous fungus Trichoderma reseei. The activity of the purified recombinant enzymes on lignocellulosic biomass (corn stover), in combination with commercial endoglucanases and β-glucosidases, resulted in a conversion of glucans to glucose of approximately 40% after 48 h of incubation, which is approximately the 67% relative to the activity of the T. reesei Cel7A enzyme (commercial reference enzyme). The study of LPMOs has gained interest in recent years because it has been demonstrated that they can improve biomass conversion efficiency by facilitating the access of GHs to highly recalcitrant regions of cellulose. By employing an oxidative mechanism in presence of an external electron donor, they generate cleavage of glycosidic bonds on crystalline cellulose and disrupt its recalcitrant structure. Recombinant enzymes PsAA9A, PsAA9B and PsAA9C were expressed using the expression platform of the yeast Pichia pastoris. PsAA9C resulted in an insoluble protein while PsAA9A and PsAA9B were successfully purified from the culture supernatant. Both enzymes were tested on cellulosic substrates, although only PsAA9A had activity, so its biochemical characterization was carried out. In the presence of an electron donor, PsAA9A acts on cellulosic substrates and generates soluble, native and oxidized cello-oligosaccharides, with degrees of polymerization between 2 and 6. Synergistic activity was demonstrated in complementarity assays with individual commercial cellulases, in the release of cellobiose as a complement to endoglucanases (GH5) and cellobiohydrolases II (non- reducing ends) (GH6), although not to cellobiohydrolases I (reducing end) (GH7). There was also synergism in the conversion to glucose, when complementing a β-glucosidase (GH1). Therefore, PsAA9A showed great potential to be used as part of an enzymatic consortium in the deconstruction of lignocellulosic materials. Regarding Cellulomonas sp. B6 xylan debranching enzymes were selected, a critical step for the degradation of hemicellulose, and were tested as a complement to xylanases. The efficient degradation of arabinoxylans (AXs) and glucuronoxylans (GXs) is of great interest since they are the predominant types of hemicellulose in cereals and pastures (AXs) and in hardwoods (Gxs). For this, the use of enzymes with α-L-arabinofuranosidase and α-glucuronidase activity capable of hydrolysing arabinose and glucuronic acid substitutions, respectively, is essential because they allow better access to the substrate for other enzymes with activity on the main chain, such as β-1,4-endoxylanases. An α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) of the GH62 family (CsAbf62A) and an α-glucuronidase (EC 3.2.1.139) of the GH67 family (CsAgu67A) were cloned and expressed as recombinant in an Escherichia coli expression platform. Both enzymes were purified from the cytoplasmic fraction of recombinant E. coli cells and were biochemically and functionally characterized. CsAbf62A exhibited α-L-arabinofuranosidase activity (EC 3.2.1.55) on AXs and arabino-xylo-oligosaccharides, specifically hydrolysing simple substitutions of arabinose linked by α-1,2 or α-1,3 bonds to xylose residues that form the backbone of the polysaccharide. Arabinose substitutions were also cleaved by CsAbf62A from arabinan, another polysaccharide present in the plant cell wall. CsAgu67A exhibited α-glucuronidase activity (EC 3.2.1.139), removing 4-O-methyl D-glucuronic acid substitutions from the reducing end of glucurono-xylo-oligosaccharides, but not from internal substitutions. Both enzymes were evaluated in combination with three β-1,4-endoxylanases (EC 3.2.1.8) of the GH10 (CsXyn10A and CsXyn10B) and GH11 (CsXyn11A) families, previously cloned and expressed in the laboratory. In residual biomass degradation assays, removal of arabinose residues by CsAbf62A improved the accessibility of CsXyn10A xylanase to wheat AX, increasing the concentration of released xylobiose, compared to the activity of CsXyn10A alone. On the other hand, the release of xylose from beechwood GX by CsXyn10A and CsXyn10B increased significantly in the presence of CsAgu67A and a commercial β-1,4-exoxylosidase. The results obtained in this work allowed for a repertoire of complementary enzymatic activities, necessary to improve the degradation efficiency of the polysaccharides present in the lignocellulosic biomass. The availability of these enzymes will allow the development of optimal formulations of enzyme complexes, specific for each type of biomass and application process. This lays the foundations for the design of "tailor-made" enzymatic cocktails, for their application in the production of hexoses and pentoses and/or in the functionalization of polysaccharides.
Citación:
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Garrido, Mercedes María. (2022). Enzimas microbianas activas sobre polisacáridos estructurales de pared celular vegetal : producción recombinante y caracterización bioquímica y funcional. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7084_Garrido
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Garrido, Mercedes María. "Enzimas microbianas activas sobre polisacáridos estructurales de pared celular vegetal : producción recombinante y caracterización bioquímica y funcional". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2022.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7084_Garrido
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