Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Estudio de los mecanismos de resistencia a tamoxifeno y palbociclib en cáncer de mama |
| Título alternativo: | Study of the mechanisms of resistance to tamoxifen and palbociclib in breast cancer |
| Autor: | Rodríguez, María Jimena |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Fundación del Instituto de Biología y Medicina Experimental - CONICET. Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME)
|
| Publicación en la Web: | 2022-07-05 |
| Fecha de defensa: | 2021-12-23 |
| Fecha en portada: | 2021 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Director: | Novaro, Virginia |
| Consejero: | Tesone, Marta |
| Jurado: | Davio, Carlos Alberto; Gatelli, Albana; Rossi, Mario |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | CANCER DE MAMA; RESISTENCIA; TAMOXIFENO; PALBOCICLIB; PI3K/AKT/MTORBREAST CANCER; RESISTANCE; TAMOXIFEN; PALBOCICLIB; PI3K/AKT/MTOR |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7030_Rodriguez |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7030_Rodriguez.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7030_Rodriguez |
| Ubicación: | Dep.QUI 007030 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Rodríguez, María Jimena. (2021). Estudio de los mecanismos de resistencia a tamoxifeno y palbociclib en cáncer de mama. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7030_Rodriguez |
Resumen:
El cáncer de mama es la neoplasia maligna con la incidencia y mortalidad más alta en mujeres en el mundo. Aproximadamente el 70% de los tumores de mama expresan receptores de estrógenos (ER) y de progesterona (PR) y son por eso susceptibles al tratamiento con inhibidores hormonales como el tamoxifeno. Si bien la terapia hormonal es eficaz para el tratamiento de estos tumores, un alto porcentaje de los pacientes eventualmente recae a esta terapia. Recientemente se ha aprobado el uso de inhibidores de ciclo celular, como el palbociclib, para el tratamiento de los pacientes que recaen a la terapia endócrina o que presentan cáncer de mama metastásico. Sin embargo, de igual forma que con el tratamiento hormonal, estos pacientes eventualmente dejan de responder al tratamiento o incluso algunos no responden desde el comienzo. El objetivo general de este trabajo fue estudiar los mecanismos de resistencia asociados al tratamiento con tamoxifeno y con palbociclib, para poder proponer mejores estrategias terapéuticas para los pacientes que recaen a los mismos, así como también para evitar o retrasar el desarrollo de resistencia. Para esto, utilizamos las líneas de cáncer de mama humano T47D y MCF-7 para generar variantes resistentes a ambas drogas por presión selectiva con dichos agentes por 12 a 24 meses. Generamos primero las variantes resistentes a tamoxifeno (T47D-TR y MCF-7-TR) y a palbociclib (T47D-PR y MCF-7-PR), y luego a partir de las resistentes a tamoxifeno generamos las variantes doble resistentes a tamoxifeno y palbociclib (T47D-TPR y MCF-7-TPR), simulando la secuencia terapéutica utilizada en la clínica. Evaluamos la morfología de las líneas resistentes creciendo en 2D y observamos que presentan mayor atipia celular que las líneas parentales, forman estructuras irregulares y desorganizadas creciendo en 3D sobre Geltrex y en suspensión como mamosferas, lo cual se correlaciona con una expresión aberrante o reducida de E-cadherina. Además, encontramos que la variante resistente a tamoxifeno T47D-TR presenta un aumento en la capacidad de formar mamosferas, así como en la expresión de marcadores de stemness. A su vez, tanto la variante resistente a tamoxifeno MCF-7-TR como la resistente a palbociclib MCF-7-PR presentan una mayor capacidad migratoria que la línea wild type. Por otra parte, las variantes resistentes presentan una menor tasa de proliferación que la línea parental, tanto in vitro como in vivo. En contraposición a esto, encontramos aumento en la expresión de proteínas del ciclo celular como ciclina D1, ciclina E2, CDK4, CDK6 y CDK1 y disminución en Rb, dependiendo de la variante analizada. Encontramos también una menor expresión de ER y PR en las variantes resistentes, así como también un aumento en la activación de la vía de PI3K/AKT/mTOR a nivel de AKT o de la proteína ribosomal S6, y un aumento en PKCα. Evaluamos la sensibilidad in vitro de las variantes a inhibidores de PI3K/AKT/mTOR que actúan a distintos niveles de la vía, y encontramos un mayor efecto inhibitorio utilizando rapamicina (inhibidor de mTOR) que utilizando alpelisib (inhibidor de PI3Kα). Además, observamos que la combinación de rapamicina con palbociclib es más efectiva que los tratamientos, tanto in vitro como in vivo, no solo en reducir la proliferación y el crecimiento tumoral, sino también inhibiendo la expresión de proteínas del ciclo celular y la activación de la vía de PI3K/AKT/mTOR. Finalmente, para validar los resultados obtenidos en las líneas celulares, utilizamos xenotrasplantes derivados de pacientes (PDX) obtenidos a partir de biopsias de pacientes con tumores de mama ER+, sensibles y resistentes a tamoxifeno y palbociclib. Disgregamos los PDXs para obtener células individuales, las cuales fueron crecidas ex-vivo en 3D sobre Matrigel. Observamos que la mayoría de los cultivos son sensibles al tratamiento con alpelisib (inhibidor de PI3Kα). Por otra parte, la totalidad de los PDXs analizados son sensibles al tratamiento con everolimus (inhibidor de mTOR), independientemente de la presencia de mutaciones o alteraciones en genes de la vía de PI3K/AKT/mTOR. Además, la triple combinación de palbociclib con everolimus y fulvestrant (inhibidor de ER) es más efectiva que las drogas individuales, no solo inhibiendo proteínas del ciclo celular sino también la activación de la vía de PI3K/AKT/mTOR. En conjunto, nuestros resultados indican que el tratamiento combinado de palbociclib con inhibidores de mTOR es efectivo tanto en un contexto de resistencia a tamoxifeno como a palbociclib, inhibiendo en paralelo tanto la proliferación celular y el crecimiento tumoral como la activación del eje ciclina D1/CDK4/6/Rb y de la vía de PI3K/AKT/mTOR. Esta combinación podría evitar una reactivación de esta vía downstream mTOR y así retrasar el desarrollo de resistencia. En conclusión, en este trabajo generamos y caracterizamos modelos experimentales de resistencia adquirida a tamoxifeno y a palbociclib, simulando la secuencia terapéutica utilizada en la clínica. Estos modelos son útiles para estudiar tanto en cultivo celular como in vivo los mecanismos asociados al desarrollo de resistencia, para de esta manera poder proponer mejores estrategias terapéuticas para el tratamiento de los tumores de mama que recaen a estos esquemas, así como también contribuir a la identificación de posibles biomarcadores de respuesta terapéutica.
Abstract:
Breast cancer is the malignant neoplasm with the highest incidence and mortality in women worldwide. Approximately 70% of breast tumors express estrogen (ER) and progesterone (PR) receptors and are therefore sensitive to endocrine inhibitors, such as tamoxifen. Although endocrine therapy is effective for the treatment of these tumors, a significant amount of patients eventually relapse. Recently, the use of cell cycle inhibitors such as palbociclib has been approved for the treatment of patients that relapse to hormone therapy or have metastatic breast cancer. However, patients ultimately relapse to this treatment, or do not respond from the beginning. The aim of this work was to study the mechanisms of resistance associated with tamoxifen and palbociclib treatment, in order to propose better therapeutic strategies for patients to avoid or delay cancer relapse. To accomplish this, we exposed T47D and MCF-7 breast cancer cell lines to progressively increasing concentrations of tamoxifen or palbociclib over a period of 12 to 24 months, thus generating resistant variants. Firstly, we obtained the tamoxifen-resistant variants (T47D-TR and MCF-7-TR) and palbociclib-resistant variants (T47D-PR and MCF-7-PR). We next used the tamoxifen-resistant variants to generate the double resistant variants (T47D-TPR and MCF-7-TPR), as a means to mimic the treatment sequence used in the clinic. We evaluated the morphology of the resistant variants growing in 2D and found that they display increased cellular atypia compared to their parental lines. They also form irregular and disorganized structures growing in 3D on Geltrex and in suspension as mammospheres, which correlates with an aberrant or reduced E-cadherin expression.Furthermore, the tamoxifen-resistant variant T47D-TR shows increased mammosphere forming capacity, in concordance with higher expression of stemness markers. Moreover, both the tamoxifen-resistant variant MCF-7-TR and the palbociclib-resistant variant MCF-7-PR display enhanced migratory capacity. Regarding cell proliferation, the resistant cell lines show decreased growth rate compared to the parental cell line, both in vitro and in vivo. On the other hand, we found cell cycle proteins such as cyclin D1, cyclin E2, CDK4, CDK6 and CDK1 to be increased in the resistant variants in contrast with their reduced proliferation rates, as well as reduced Rb. Additionally, the resistant variants exhibit lower expression of ER and PR, overactivation of PI3K/AKT/mTOR pathway at the level of AKT or ribosomal protein S6, and higher expression of PKCα than the wild type. We next evaluated the response of these cell lines to different PI3K/AKT/mTOR inhibitors that act at different levels of the pathway. We found that rapamycin (mTOR inhibitor) was more effective in suppressing cell proliferation than alpelisib (PI3K inhibitor). Furthermore, rapamycin and palbociclib combination had a greater effect than each drug used separately in suppressing cell proliferation and tumor growth as well as in reducing cell cycle proteins and PI3K/AKT/mTOR activation. Finally, in order to validate these results, we used patient derived xenografts (PDX) obtained from ER+ breast cancer patients that harbored sensitive or resistant tumors to tamoxifen and palbociclib. We disaggregated the PDXs to obtain single cells which were next grown on Matrigel. We found that most cultures are sensitive to alpelisib (PI3K inhibitor), whereas the totality of PDXs are sensitive to everolimus (mTOR inhibitor), regardless of the presence of mutations or alterations in PI3K/AKT/mTOR pathway. The triple combination of palbociclib with everolimus and fulvestrant (ER inhibitor) is also more effective than each drug separately in reducing cell cycle proteins and PI3K/AKT/mTOR activation. Collectively, our results indicate that combined treatment of palbociclib with mTOR inhibitors is effective in the context of resistance to either tamoxifen or palbociclib by inhibiting cell proliferation and tumor growth as wells as regulating the activation of the cyclin D1/CDK4/6/Rb axis and PI3K/AKT/mTOR pathway. The proposed combination could therefore prevent pathway reactivation downstream mTOR, delaying the development of resistance. In conclusion, in this work we were able to generate and characterize experimental models of acquired resistance to tamoxifen and palbociclib, following the therapeutic sequence used in the clinic. These models are useful to study the mechanisms associated with resistance both in cell culture and in vivo, in order to suggest better therapeutic strategies for patients that relapse to these therapies, as well as contribute to the identification of new biomarkers of therapeutic response.
Citación:
---------- APA ----------
Rodríguez, María Jimena. (2021). Estudio de los mecanismos de resistencia a tamoxifeno y palbociclib en cáncer de mama. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7030_Rodriguez
---------- CHICAGO ----------
Rodríguez, María Jimena. "Estudio de los mecanismos de resistencia a tamoxifeno y palbociclib en cáncer de mama". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2021.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7030_Rodriguez
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