Rol del eje Galectina-1/glicanos durante los procesos de diseminación y metástasis en cáncer de mama

Perrotta, Ramiro Martín

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Título:	Rol del eje Galectina-1/glicanos durante los procesos de diseminación y metástasis en cáncer de mama
Título alternativo:	Role of the Galectin-1 / glycans axis during the dissemination and metastasis of breast cancer
Autor:	Perrotta, Ramiro Martín
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Fundación del Instituto de Biología y Medicina Experimental - CONICET. Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME)
Publicación en la Web:	2024-01-09
Fecha de defensa:	2021-12-14
Fecha en portada:	2021
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Director:	Salatino, Mariana
Director Asistente:	Rabinovich, Gabriel Adrián
Consejero:	Saravia, Flavia Eugenia
Jurado:	Kordon, Edith Claudia; Llera, Andrea Sabina; Peters, María Giselle
Idioma:	Español
Palabras clave:	CANCER DE MAMA; CELULAS MADRE TUMORALES; EXOSOMAS; GALECTINA-1; GLICOSILACION; INMUNOSUPRESION; METASTASIS; ST6GAL1; TRANSICION EPITELIO MESENQUIMALBREAST CANCER; CANCER STEM CELLS; EXOSOMES; EPITHELIAL TO MESENCHYMAL TRANSITION; GALECTIN-1; GLYCOSYLATION; IMMUNOSUPPRESSION; ST6GAL1; METASTASIS
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7027_Perrotta
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7027_Perrotta.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7027_Perrotta
Ubicación:	Dep.QUI 007027
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Perrotta, Ramiro Martín. (2021). Rol del eje Galectina-1/glicanos durante los procesos de diseminación y metástasis en cáncer de mama. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7027_Perrotta

Resumen:

Las galectinas son una familia de proteínas capaces de decodificar la información contenida en glicanos presentes tanto en la superficie celular como en la matriz extracelular, modulando así distintos procesos fisiopatológicos. En particular, galectina-1 (Gal1) se une a los residuos terminales de N-acetilactosamina en N- y en O-glicanos, sólo si estos carecen de terminales de ácido siálico (AS) en posición α2-6 (glicofenotipo permisivo para la unión de Gal1). El objetivo principal de mi proyecto de tesis doctoral es explorar el rol del eje Gal1/glicanos tanto en la mama normal como neoplásica, haciendo foco en cómo esta interacción modula los procesos de invasión y diseminación metastásica. En primer lugar, nos propusimos identificar cuáles son las células productoras de Gal1 en la mama normal murina y humana utilizando datos públicos de estudios de single cell RNA sequencing (scRNAseq) que abarcan las distintas fases del desarrollo mamario. Observamos que en la mama normal Gal1 (codificada por el gen Lgals1) se expresa principalmente en las células del linaje basal/mioepitelial y en células madre multipotenciales (MaSC). Utilizando la técnica de RNA velocity, comprobamos la dinámica de expresión de Gal1 en dichos linajes celulares. Para analizar más en profundidad la relevancia de Gal1 en el epitelio mamario, se analizaron las mamas normales de ratones C57BL/6 WT y Lgals1-/- (Gal1KO) luego de promover la ramificación de los ductos y las terminales con el análogo sintético de la progesterona MPA. Sorpresivamente observamos que los ratones Gal1KO tenían severamente afectada la capacidad de desarrollar las ramificaciones terminales, antes y después de ser estimulados con MPA, sugiriendo que Gal1 cumple un rol relevante en la fisiología de la glándula mamaria. Debido a que las células neoplásicas son capaces de cooptar los mecanismos fisiológicos de diseminación e invasión para generar metástasis, nos propusimos investigar el rol de Gal1 en el modelo murino transgénico para el oncogén HER2 FVB/N-Tg (MMTV/NeuT), capaz de desarrollar lesiones preneoplásicas y metástasis entre las 14 y 18 semanas de vida. Datos provenientes del análisis de RNAseq revelaron que Gal1 se regula positivamente en lesiones tempranas tumorales (LT: 14 semanas) con respecto a los tumores primarios (TP: 18 semanas) sugiriendo que la expresión de esta lectina constituye un evento temprano en fenómenos de tumorigénesis. Estos resultados sugieren que la expresión de Gal1 y su unión a las células tumorales podrían estar asociadas a la diseminación tumoral. En efecto, observamos que el tratamiento de cultivos 3D de LT con Gal1 promovió un fenotipo invasivo caracterizado por el aumento de marcadores de células madre tumorales (CSC) y transición epitelio mesenquimal (TEM) tales como TWIST, SNAIL y SLUG y la disminución de E-caderina. Posteriormente, nos propusimos analizar la relevancia de Gal1 en procesos de diseminación y metástasis en cáncer de mama humano HER2+. Para ellos, seleccionamos líneas tumorales de mama humanas con distinto potencial metastásico (JIMT-1 y BT- 474). La línea JIMT-1 (más agresiva) presentó mayor expresión de Gal1 y menor expresión de la sialiltransferasa ST6Gal1 que cataliza la adición de AS en posición α2-6. A partir de estos hallazgos hipotetizamos que la unión de Gal1 a la célula tumoral podría promover un fenotipo maligno. En este contexto observamos que el tratamiento con Gal1 de la línea JIMT-1, incrementó la frecuencia de CSC (CD44high/CD24low). A su vez, promovió la migración celular, un aumento de marcadores de TEM y fomentó la formación de mamosferas en cultivo. Para evaluar el efecto in vivo de la administración de Gal1 utilizamos un PDX (patient derived xenograft) derivado de una paciente con cáncer de mama HER2+; donde el tratamiento con Gal1 recombinante (intratumoral) promovió un aumento en la diseminación metastásica en el pulmón del huésped. Para determinar la relevancia clínica de nuestros hallazgos analizamos bases de datos públicas con información transcriptómica de pacientes con cáncer de mama (TCGA-BRCA). Encontramos que aquellos pacientes con tumores de mama de todos los subtipos que presentaban simultáneamente alta expresión de mensajero de Gal1 (LGALS1) y bajos niveles de ST6GAL1 (LGALS1high/ST6GAL1low), evolucionaron con un peor pronóstico y una menor sobrevida libre de enfermedad. Mas aún, el análisis de enriquecimiento (GSEA) reveló que dichos pacientes tienen regulada positivamente la vía de TEM, e inhibidas las vías asociadas a la respuesta inmune antitumoral. El análisis de enriquecimiento de células inmunes (MIXTURE), demostró que estos tumores exhiben un menor infiltrado de células T CD8+ citotóxicas y una mayor frecuencia de macrófagos inmunosupresores con fenotipo M2. Finalmente, debido a que los tumores producen cantidades sustanciales de Gal1 que se libera al medio extracelular a través de una vía no tradicional y aún desconocida, presumimos que Gal1 podría externalizarse en exosomas, contribuyendo así a la inmunosupresión a distancia y específica de tejido. Observamos que exosomas CD63+ purificados a partir de células de cáncer de mama murino triple negativo 4T1 y humano HER2+ JIMT-1 contenían altos niveles de Gal1. Además, Gal1 colocalizó con el marcador de exosomas CD63 y luego de la lisis de los mismos, detectamos niveles más altos de Gal1 en el medio extracelular (ME). La inhibición de la esfingomielinasa neutra, una enzima clave en la vía de liberación del exosomas, por GW4869 disminuyó el contenido de Gal1 en el ME. La adición de exosomas Gal1+ (y no aquéllos derivados de células Gal1 KO), inhibió la proliferación in vitro de células T CD4+ y CD8+ y disminuyó la expresión de Gzmb e IL-2 en células T CD4. Nuestros datos demuestran que Gal1 es secretada a través de exosomas derivados de células de cáncer de mama presentando capacidad inmunosupresora sobre células T. En resumen, nuestros resultados en conjunto demuestran la relevancia de Gal1 en la glándula mamaria normal, y enfatizan su rol crítico en la diseminación metastásica e inmunosupresión a distancia en cáncer de mama. En base a nuestros datos experimentales usando modelos murinos y humanos, y validados desde el punto de vista clínico, proponemos a la dupla génica LGALS1/ST6GAL1 como posible biomarcador capaz de predecir la sobrevida de pacientes en cáncer de mama humano y como un posible blanco terapéutico de nuevas terapias antimetastásicas.

Abstract:

Galectins are a family of proteins capable of decoding the information contained in glycans present both on the cell surface and in the extracellular matrix, thus modulating different pathophysiological processes. Galectin-1 (Gal1) binds to N-acetylactosamine structures both in N- and O-glycans in the absence of α2-6 sialic acid (SA) capping (Gal1-binding restrictive phenotype). The main goal of this PhD thesis work is to explore the role of the Gal1/glycans axis in both normal mammary gland and breast tumors, focusing on how this interaction modulates invasion and metastatic dissemination. First, we aimed to identify the source of Gal1 in the normal murine and human mammary gland using public data from single-cell RNA sequencing (scRNAseq) studies covering the different developmental stages. We observed that in the normal gland, Gal1 (encoded by Lgals1 gene) is expressed mainly in cells of the basal/myoepithelial lineage and multipotential stem cells (MaSC). Using the RNA velocity technique, we confirmed the expression dynamics of Gal1 in these cell lineages. To further analyze the relevance of Gal1 in mammary epithelium, normal mammary glands of WT C57BL/6 and Lgals1-/- (Gal1KO) mice were analyzed after promoting duct and terminal branching with the progesterone synthetic analog medroxyprogesterone acetate (MPA). Surprisingly, we observed that Gal1-deficient mice presented lower terminal end buds branching before and after MPA stimulation, suggesting that Gal1 plays a relevant role in mammary gland physiology. Since transformed cells may co-opt physiological mechanisms of dissemination and invasion to metastasize, we investigated the role of Gal1 in the murine HER2 transgenic model FVB/N-Tg (MMTV/NeuT), capable of developing pre-neoplastic lesions and metastasis between 14 and 18 weeks. Data from RNAseq analysis revealed that Gal1 was upregulated in early tumor lesions (EL: 14 weeks) in comparison with primary tumors (PT: 18 weeks), suggesting that expression of this lectin constitutes an early event during tumorigenesis. These results suggest that expression of Gal1 and its binding capacity to tumor cells could promote tumor spread. Indeed, we observed that treatment of 3D cultures of EL with recombinant Gal1 promoted an invasive phenotype characterized by an increase of cancer stem cell (CSC) markers and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) mediators such as TWIST, SNAIL, and SLUG as well as downregulation of E-cadherin. Subsequently, we analyzed the relevance of Gal1 in dissemination and metastasis in HER2+ human breast cancer. We first selected cell lines with different metastatic potentials (JIMT-1 and BT-474). The JIMT-1 cell line (more aggressive) presented higher expression of Gal1 and lower expression of the sialyltransferase ST6Gal1 that catalyzes the addition of SA α2-6. From these findings, we hypothesized that the binding of Gal1 to the tumor cell could promote a malignant phenotype. In this context, we observed that treatment of the JIMT-1 cell line with recombinant Gal1 increased the frequency of CSC populations (CD44high- int/CD24low). Furthermore, Gal1 promoted cell migration, increased EMT markers, and favored the formation of mammospheres in culture. To evaluate the in vivo effects of Gal1 administration, we used a PDX (patient-derived xenograft) derived from a HER2+ breast cancer patient; treatment with Gal1 (intratumoral) favored metastatic spread to the host lung. To determine the clinical relevance of our findings, we analyzed public databases with transcriptomic data from breast cancer patients (TCGA-BRCA). We found that those breast cancer patients with tumors that simultaneously presented high LGALS1 expression and low ST6GAL1 (LGALS1high/ST6GAL1low) levels, had a poor prognosis and disease-free survival. Furthermore, the enrichment analysis (GSEA) revealed that these patients upregulated the EMT pathway, and downregulated pathways associated with the antitumor immune response. Immune cell enrichment analysis (MIXTURE) demonstrated that these tumors exhibited a lower infiltrate of cytotoxic CD8+ T cells and a higher frequency of immunosuppressive M2 macrophages. Finally, since tumors produce substantial amounts of this lectin that is released to the extracellular environment through a still unknown non-canonical pathway, we hypothesized that Gal1 could be externalized within exosomes, thus contributing to tissue-specific and distant immunosuppression. CD63+ exosomes purified from 4T1 triple-negative murine breast cancer cells and HER2+ JIMT-1 human breast cancer cells contained high levels of Gal1. Furthermore, Gal1 colocalized with the CD63 exosome marker and after lysis, we detected higher levels of Gal1 in the extracellular medium (EM). GW4869-mediated inhibition of neutral sphingomyelinase, a key enzyme in the exosome release pathway, decreased Gal1 content in the EM. The addition of Gal1+, but not Gal1-deficient exosomes inhibited in vitro proliferation of CD4+ and CD8+ T cells and decreased Gzmb and IL-2 expression in CD4 T cells. These data demonstrate that Gal1 is secreted through exosomes derived from breast cancer cells and exhibsi T-cell immunosuppressive capacity. In summary, our results demonstrate the relevance of Gal1 in the normal mammary gland and emphasize its critical role in the metastatic spread and immunosuppression of breast cancer. Based on our experimental data using murine and human models, and validated from the clinical standpoint, we propose the LGALS1/ST6GAL1 gene pair as a possible biomarker capable of predicting the outcome of human breast cancer patients and as a novel therapeutic target of anti-metastatic therapies.

Citación:

---------- APA ----------

Perrotta, Ramiro Martín. (2021). Rol del eje Galectina-1/glicanos durante los procesos de diseminación y metástasis en cáncer de mama. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7027_Perrotta

---------- CHICAGO ----------

Perrotta, Ramiro Martín. "Rol del eje Galectina-1/glicanos durante los procesos de diseminación y metástasis en cáncer de mama". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2021.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7027_Perrotta

Estadísticas:

Descargas totales desde :

Navegar

Colección

Tesis Doctoral