Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Nanoscopía de fluorescencia con uso eficiente de fotones mediante el escaneo de mínimos de intensidad de luz |
| Título alternativo: | Photon-efficient fluorescence nanoscopy by scanning light intensity minima |
| Autor: | Masullo, Luciano Andrés |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | CONICET. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman" (CIBION)
|
| Publicación en la Web: | 2022-07-05 |
| Fecha de defensa: | 2021-08-30 |
| Fecha en portada: | 2021 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Físicas |
| Director: | Stefani, Fernando Daniel |
| Consejero: | Bragas, Andrea Verónica |
| Jurado: | Martínez, Oscar Eduardo; Torga, Jorge Roman; Levi, Valeria |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7022_Masullo |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n7022_Masullo.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n7022_Masullo |
| Ubicación: | Dep.FIS 007022 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Masullo, Luciano Andrés. (2021). Nanoscopía de fluorescencia con uso eficiente de fotones mediante el escaneo de mínimos de intensidad de luz. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7022_Masullo |
Resumen:
La microscopía de superresolución, o más exactamente las técnicas de nanoscopía de fluorescencia, han revolucionado la obtención de imágenes basadas en la fluorescencia alcanzando resoluciones en el rango nanométrico, mucho más allá del límite de difracción de la luz. El concepto clave es la conmutación de los fluoróforos entre un estado fluorescente y otro no fluorescente. Esta "conmutación on-off" permite la localización secuencial de un subconjunto de fluoróforos en la muestra con una precisión que supera el límite de difracción. La primera generación de nanoscopía de fluorescencia estaba compuesta por dos familias de técnicas: métodos dirigidos por coordenadas y métodos de localización estocástica. En los métodos dirigidos por coordenadas, como el Stimulated Emission Depletion (STED) o el REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions (RESOLFT), el proceso de desconexión es inducido por la luz y la imagen superresuelta se obtiene mediante el barrido de un campo óptico espacialmente modulado que controla la depleción de los fluoróforos en posiciones predefinidas de la muestra. En cambio, los métodos de localización estocástica, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) o la microscopía de localización fotoactivada (PALM), utilizan una iluminación uniforme. En este caso, se obtienen imágenes de fluoróforos individuales y bien separados que se encienden y apagan estocásticamente en la muestra. La imagen superresuelta se reconstruye utilizando las posiciones de cada fluoróforo medido, que se obtienen a partir de los ajustes de sus imágenes individuales a la función de dispersión de puntos del microscopio. Estas técnicas están ahora bien establecidas con microscopios comerciales de varias empresas disponibles en el mercado. Aunque no existe un límite fundamental para la resolución espacial de estos métodos, en la práctica alcanzan entre 20 y 30 nm de resolución lateral debido al limitado número de fotones de fluorescencia detectables, impuesto principalmente por la fotodegradación de los fluoróforos. Naturalmente, es interesante alcanzar resoluciones más altas para acceder a la escala entre 1 y 20 nm. Especialmente interesante sería alcanzar el régimen de sub-10 nm, ya que ese es el tamaño típico de las proteínas estructurales. Por lo tanto, estos métodos permitirían estudiar las estructuras proteicas supramoleculares con resolución molecular en condiciones biológicamente compatibles. Por lo tanto, es interesante investigar las vías para conseguir métodos de nanoscopía de fluorescencia más eficientes con respecto a los fotones detectados. Recientemente, la técnica Maximally INFormative LUminescence eXcitation (MINFLUX) ha puesto en marcha una nueva generación de métodos de nanoscopía de fluorescencia que combina las ventajas de los métodos dirigidos por coordenadas y métodos de localización estocástica, para extraer la máxima información posicional de una única molécula utilizando un número mínimo de fotones. MINFLUX utiliza campos de excitación que comprenden un mínimo de intensidad para interrogar la posición de moléculas individuales y puede ofrecer de forma rutinaria una precisión de localización de ~ 1 nm. En esta Tesis, se presentan nuevos métodos eficientes en uso de fotones para localizar moléculas individuales con luz estructurada con un mínimo de intensidad. El Capítulo 1 describe los fundamentos de la microscopía de fluorescencia y la nanoscopía de fluorescencia. Se presentan los principios comunes subyacentes. Se revisan los diferentes tipos de técnicas de nanoscopía, incluidos los desarrollos más recientes, y se resume el estado de la técnica en este campo. En el Capítulo 2 se presenta el desarrollo de una versión paralelizada de la nanoscopía RESOLFT dirigida por coordenadas. Este microscopio utiliza una combinación de dos patrones de luz de campo amplio: una matriz de mínimos de luz y un patrón de focos múltiples. Este novedoso esquema de iluminación consigue una mayor sensibilidad al mejorar la detección de fotones y el rechazo del fondo, proporcionando la mejor combinación de campo de visión y resolución espacio-temporal reportada en microscopía de células vivas en el momento de escribir esta Tesis: 50 nm resolución lateral y tiempos de adquisición de 1 s para la obtención de imágenes de células enteras. El Capítulo 3 describe la localización de moléculas fluorescentes individuales mediante una secuencia de exposiciones a patrones de luz estructurada. Se discuten los trabajos anteriores en este campo y se desarrolla y describe un marco matemático común que utiliza la teoría de la Estimación de Máxima Verosimilitud (MLE). Este marco matemático sirve para comparar diferentes métodos y también facilita el diseño de nuevos esquemas experimentales. Como ejemplo, se proponen dos nuevos métodos de localización que combinan los puntos fuertes de los esquemas existentes. En el Capítulo 4 se presenta una implementación novedosa y simplificada del concepto de localización MINFLUX. A diferencia de la implementación original, p-MINFLUX utiliza pulsos láser intercalados para suministrar los focos de excitación de forma toroidal a una velocidad de repetición máxima, generando así un barrido efectivo a escala de nanosegundos de los mínimos de luz. Utilizando sistemas modelo de origami de ADN tanto estáticos como dinámicos, demostramos su efectividad para la nanoscopía de localización de moléculas individuales y el tracking o seguimiento, respectivamente. La precisión de la localización de 1 − 2 nm se consigue con 2000 − 1000 fotones. Además, p-MINFLUX proporciona acceso al tiempo de vida de la fluorescencia. Hemos aplicado esta información para adquirir señales multiplexadas discernidas por el tiempo de vida y para realizar microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) con una resolución de 3 − 4 nm (precisión de localización de 1 − 2 nm), que es una resolución al menos un orden de magnitud mejor que la reportada previamente en imágenes de tiempo de vida. En el Capítulo 5 se describe el desarrollo de un nuevo método de localización de moléculas individuales utilizando mínimos de luz. Al escanear un haz de luz que presenta un mínimo de intensidad (idealmente un cero) sobre una molécula individual fluorescente, la posición del emisor puede estimarse con precisiones equivalentes a MINFLUX o mejores. A diferencia del MINFLUX, que requiere montajes de gran complejidad técnica, este enfoque de escaneo rasterizado del mínimo de excitación puede implementarse directamente en cualquier microscopio de escaneo láser simplemente introduciendo un elemento óptico pasivo, como una placa de fase vortical, para obtener un foco en forma de toroide. Caracterizamos el rendimiento de este nuevo método mediante cálculos teóricos, simulaciones numéricas y experimentos de nanoscopía. Por último, las conclusiones de esta Tesis y las perspectivas a futuro se desarrollan en el Capítulo 6.
Abstract:
Super-resolution microscopy, or more accurately fluorescence nanoscopy techniques have revolutionized fluorescence-based imaging reaching resolutions in the nanometer range, well beyond the diffraction limit of light. The key enabling concept is the switching of fluorophores between a fluorescent and a non-fluorescent state. This "on-off switching" enables the sequential localization of a subset of fluorophores on the sample with a precision beyond the diffraction limit. The first generation of fluorescence nanoscopy was composed of two families of techniques: coordinate targeted and coordinate stochastic methods. In coordinate targeted methods, such as Stimulated Emission Depletion (STED) or REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions (RESOLFT), the off-switching process is light-induced and the super-resolved image is obtained by scanning a spatially modulated optical field that controls the off-switching of fluorophores on predefined positions of the sample. In contrast, coordinate stochastic methods such as Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) or Photo-activated localization microscopy (PALM), use uniform illumination. In this case, individual and well-separated fluorophores are imaged as they switch on and off stochastically over the sample. The super-resolved image is reconstructed using the positions of each measured fluorophore, which are obtained from fits of their individual images to the point spread function of the microscope. These techniques are now well established with commercial microscopes available in the market from several companies. Although there is no fundamental limit to the spatial resolution of these methods, in practice they hardly reach 20 to 30 nm of lateral resolution due to the limited number of detectable fluorescence photons, imposed mainly by the photo-degradation of fluorophores. Naturally, it is of interest to achieve higher resolutions in order to access to the scale between 1 and 20 nm. Particularly interesting would be to reach the sub-10 nm regime because that is the typical size of structural proteins. Therefore, such methods would enable the study of supramolecular protein structures with molecular resolution under biologically compatible conditions. It is therefore of interest to investigate routes for more photon-efficient methods of fluorescence nanoscopy. Recently, the technique Maximally INFormative LUminescence eXcitation (MINFLUX) has launched a new generation of fluorescence nanoscopy methods that combines the advantages of coordinate-stochastic and coordinate-targeted methods, to extract maximum positional information of a single molecule using minimal photon counts. MINFLUX uses excitation fields comprising an intensity minimum to interrogate the position of single molecules and can routinely deliver a localization precision of ~ 1 nm. In this Thesis, new photon-efficient methods to localize single molecules with structured light featuring a minimum of intensity are presented. Chapter 1 describes the fundamentals of fluorescence microscopy and fluorescence nanoscopy. The common underlying principles are presented. The different types of nanoscopy techniques, including the most recent developments, are reviewed and the state of the art of the field is summarized. In Chapter 2 the development of a parallelized version of the coordinate-targeted RESOLFT nanoscopy is presented. This microscope uses a combination of two widefield light patterns: an array of light minima and a multi-foci pattern. This novel illumination scheme achieves higher sensitivity by enhancing photon collection and background rejection, delivering the best reported combination of field of view and spatiotemporal resolution in live-cell microscopy at the time of writing this thesis: 50 nm lateral resolution and 1 s acquisition times for whole cell imaging. Chapter 3 describes the localization of single fluorescent molecules by using a sequence of exposures to structured light patterns. Previous work on the field is discussed and a common mathematical framework using Maximum Likelihood Estimation (MLE) theory is developed and described. This mathematical framework serves as a way to benchmark different methods and also facilitates the design of new experimental schemes. As an example, two new localization methods which combine the strengths of existing schemes are proposed. A novel and simplified implementation of the MINFLUX localization concept is presented in Chapter 4. In contrast to the original implementation, p-MINFLUX uses interleaved laser pulses to deliver the doughnut-shaped excitation foci at a maximum repetition rate thus generating an effective nanosecond-scale scan of the light minima. Using both static and dynamic DNA origami model systems, we demonstrate its performance for single-molecule localization nanoscopy and tracking, respectively. Localization precision of 1−2 nm is achieved with 2000 − 1000 photon counts. In addition, p-MINFLUX provides access to the fluorescence lifetime. We have applied this information to acquire multiplexed signals discerned by lifetime and to perform fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) with 3-4 nm resolution (1-2 nm localization precision), that it is a resolution at least one order of magnitude better than previously reported in lifetime imaging. In Chapter 5 the development of a new single-molecule localization method using light minima is described. By scanning a beam of light featuring an intensity minimum (ideally a zero) over a single fluorescent molecule, the position of the emitter can be estimated with precisions equivalent to MINFLUX or better. In contrast to MINFLUX, which requires set-ups of high technical complexity, this approach of raster scanning the excitation minimum can be directly implemented in any laser-scanning microscope simply introducing a passive optical element, such as a vortex phase plate, to obtain a doughnut-shaped focus. We characterize the performance of this new method through theoretical calculations, numerical simulations and nanoscopy experiments. Finally, the conclusions of this Thesis and future perspectives are unfolded in Chapter 6.
Citación:
---------- APA ----------
Masullo, Luciano Andrés. (2021). Nanoscopía de fluorescencia con uso eficiente de fotones mediante el escaneo de mínimos de intensidad de luz. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7022_Masullo
---------- CHICAGO ----------
Masullo, Luciano Andrés. "Nanoscopía de fluorescencia con uso eficiente de fotones mediante el escaneo de mínimos de intensidad de luz". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2021.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7022_Masullo
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