Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Estudio estructural y funcional de la familia de proteínas de tipo perforina en Babesia spp. y su rol en la interacción patógeno-hospedador. |
| Título alternativo: | Structural and functional characterization of the perforin-like protein family in Babesia spp. and their role in the host-pathogen interaction. |
| Autor: | Paoletta, Martina Soledad |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria - CONICET. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular (IABIMO)
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| Publicación en la Web: | 2022-03-29 |
| Fecha de defensa: | 2019-12-12 |
| Fecha en portada: | 2019 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Director: | Wilkowsky, Silvina Elizabeth |
| Consejero: | Hopp, Horacio Esteban |
| Jurado: | Alonso, Guillermo Daniel; Buscaglia, Carlos Andrés; Martin, Valentina |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | BABESIOSIS; BABESIA BOVIS; PROTEINAS TIPO PERFORINA; TRANSFECCION; HEMOLISIS; PROTEINA FORMADORA DE POROBABESIOSIS; BABESIA BOVIS; PERFORIN-LIKE PROTEINS; TRANSFECTION; HEMOLYSIS; PORE-FORMING PROTEIN |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6950_Paoletta |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6950_Paoletta.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6950_Paoletta |
| Ubicación: | Dep.BIO 006950 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Paoletta, Martina Soledad. (2019). Estudio estructural y funcional de la familia de proteínas de tipo perforina en Babesia spp. y su rol en la interacción patógeno-hospedador.. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6950_Paoletta |
Resumen:
La babesiosis bovina es una enfermedad transmitida por garrapatas causada por parásitos protozoarios del género Babesia que en el hospedador mamífero invaden y replican únicamente dentro de los eritrocitos. Esta enfermedad afecta la producción ganadera en regiones de clima tropical y subtropical generando importantes pérdidas económicas a nivel global. Si bien existen estrategias de prevención de la enfermedad tales como el control del vector o la vacunación con cepas atenuadas, las mismas presentan importantes limitaciones por lo que es necesario el desarrollo de estrategias superadoras para controlar la enfermedad. En ese sentido, resulta indispensable dilucidar las bases moleculares de la interacción patógeno-hospedador y estudiar las proteínas involucradas en los procesos de invasión, replicación y egreso parasitario. El objetivo de esta tesis fue caracterizar estructural y funcionalmente la familia de proteínas tipo perforina (PLP) en el género Babesia. Estas proteínas, en organismos estrechamente relacionados a Babesia como Toxoplasma gondii y Plasmodium spp., poseen capacidad de formar poros en membranas de células blanco y son esenciales para la invasión y/o egreso de la célula hospedadora. En este trabajo, se realizó la identificación y caracterización estructural de toda la familia de proteínas PLP en las distintas especies de Babesia mediante análisis bioinformáticos sobre genomas ya secuenciados. Se identificó un número variable de genes en las diferentes especies, desde 3 en B. canis a 8 en B. bigemina y B. divergens. El análisis estructural de las proteínas PLP identificadas mostró que están altamente conservadas a nivel de su estructura secundaria y terciaria tanto dentro del género como con otras proteínas PLP del phylum Apicomplexa, mientras que a nivel de estructura primaria las mismas son divergentes, manteniendo conservados sólo algunos aminoácidos de sus dominios funcionales. El análisis de datos de transcriptómica de diferentes estadios de B. bovis, la especie bovina más virulenta del género, mostró que los 6 genes plp se transcriben durante alguna etapa del ciclo de vida y tres de ellos (plp1, plp2 y plp5) tienen una transcripción estadio-específica. El gen plp1 presentó el mayor nivel de transcripción en el merozoíto, estadio presente sólo en bovinos. A través de análisis de Western blot realizados con el dominio funcional de la proteína PLP1 recombinante se demostró la presencia de anticuerpos específicos contra dicha proteína en bovinos naturalmente infectados con B. bovis indicando que PLP1 es inmunogénica y posee epítopes B inmunodominantes expuestos al sistema inmune bovino durante de la infección. Los ensayos de hemólisis in vitro con el dominio funcional de PLP1 recombinante demostraron una alta capacidad hemolítica de este dominio frente a eritrocitos bovinos en un amplio rango de condiciones de pH y concentración de Ca^2+. Para completar la caracterización funcional de la proteína PLP1 se generó una cepa de B. bovis knock out (KO) para el gen plp1 (Δplp1) por disrupción de su secuencia codificante, generada por doble recombinación homóloga. La línea clonal B. bovis Δplp1 fue caracterizada a nivel genético mediante PCR y Southern blot para verificar la correcta eliminación del gen plp1. A nivel fenotípico se observaron con regularidad en el cultivo Δplp1 formas tetraméricas formadas por dos pares de merozoítos presentes en un mismo eritrocito. Estas formaciones son inusuales en la cepa salvaje lo que indicaría la presencia de un fenotipo mutante en donde las formas apareadas no pueden egresar del eritrocito para invadir uno naïve. Por otra parte, la tasa de crecimiento en cultivos in vitro de la cepa Δplp1 fue significativamente menor respecto a la cepa salvaje, lo que indica que, si bien la expresión del gen plp1 no es esencial para la supervivencia del estadio sanguíneo, PLP1 juega un papel importante en estos estadios ya que su ausencia causa una disminución significativa en el fitness del parásito. En conclusión, tanto la conservación de la estructura de las proteínas PLPs como los ensayos funcionales de PLP1 en B. bovis sugieren que estas proteínas se expresan en el estadio en bovinos y tienen la capacidad de generar poros en membranas eritrocitarias. Los estudios realizados con la mutante Δplp1 muestran que la proteína PLP1 no es esencial para la supervivencia y el desarrollo del merozoíto en el eritrocito, lo que podría explicarse por la redundancia de PLP1 con otros miembros de la familia que podrían haber compensado su ausencia. En base a estos resultados postulamos que la proteína PLP1 está involucrada en el egreso de la célula hospedadora dado que los parásitos Δplp1 que carecen de esta proteína formadora de poros no pueden egresar de forma eficiente de los eritrocitos con la consecuente disminución del fitness del parásito. Futuros ensayos que evalúen la transcripción y expresión de los miembros de la familia PLP en la cepa Δplp1 y de replicación in vivo de esta cepa en infecciones experimentales de bovinos y garrapatas permitirán determinar si la proteína PLP1 es necesaria para la replicación y el desarrollo de otros estadios de B. bovis y si la compensación funcional con otras proteínas de la familia es capaz de suplantar su función en el fenotipo KO.
Abstract:
Bovine babesiosis is a tick-borne disease caused by protozoan parasites of the Babesia genus that invade and replicate within the host's red blood cells. This disease affects livestock production in tropical and subtropical regions causing significant economic losses worldwide. Although there are strategies to control the disease, such as vector control or vaccination with attenuated strains, they have important drawbacks. Therefore, it is necessary to develop improved strategies to control the disease. In this sense, it is essential to elucidate the molecular basis of the host-pathogen interaction including the proteins involved in the processes of parasitic invasion, replication and egress. The aim of this thesis was to characterize the family of perforin-like proteins (PLP) in the Babesia genus at the structural and functional levels. The PLP proteins of organisms closely related to Babesia such as Toxoplasma gondii and Plasmodium spp. have the ability to form pores in cell membranes and are essential for invasion and/or egress from the host cell. In this work, the identification and structural characterization of the PLP family in different Babesia species was accomplished through bioinformatics analysis on available genomes. A variable number of genes was identified in different species, ranging from 3 in B. canis to 8 in B. bigemina and B. divergens. Comparative analysis showed that the secondary and tertiary structure of PLPs are highly conserved, both within the genus and with other PLP proteins of the phylum. On the contrary, the primary amino acid sequence is divergent, conserving only a few amino acids of their functional domain. Transcriptomic data analysis from different B. bovis stages, the most virulent bovine species of the genus, showed that the 6 plp genes are transcribed during at least one stage of the life cycle and three of them (plp1, plp2 and plp5) have a stage-specific transcription. The plp1 gene showed the highest level of transcription in merozoites, a stage only present in cattle. Western blot analysis performed with the recombinant PLP1 protein demonstrated the presence of specific antibodies against it in cattle naturally infected with B. bovis, indicating that PLP1 is immunogenic and contains B-cell epitopes exposed to the bovine immune system during infection. Hemolysis assays with the functional domain of recombinant PLP1 demonstrated high hemolytic capacity against bovine red blood cells in a wide range of pH conditions and Ca^2+ concentration. To complete the functional characterization of the PLP1 protein, a B. bovis knock out (KO) strain was generated for the plp1 gene (Δplp1) by disruption of its coding sequence by double homologous recombination. The B. bovis Δplp1 clonal line was characterized at the genetic level by PCR and Southern blot to verify the correct elimination of the plp1 gene. At the phenotypic level, tetrameric forms formed by two pairs of merozoites present in the same erythrocyte were regularly observed in the Δplp1 culture. These formations are unusual in the parental strain which suggests a mutant phenotype where the paired forms cannot egress the erythrocyte to invade a naïve one. On the other hand, the in vitro growth rate of the Δplp1 strain was significantly lower compared to the wild type strain, which indicates that although expression of the plp1 gene is not essential for the survival of the blood stages, PLP1 plays an important role in these stages since its absence causes a significant decrease in the parasite's fitness. In conclusion, the conservation of the structure of the PLP proteins and the functional characterization of PLP1 in B. bovis suggest that these proteins are expressed in merozoites and have the ability to generate pores in the erythrocyte membrane. Studies on the endogenous PLP1 show that this protein is not essential for the survival and development of merozoite in the erythrocyte, which could be explained by the redundancy of PLP1 with other family members, that could have compensated for its absence. The PLP1 protein is probably involved in the egress of the parasite from the host cell and since Δplp1 parasites lack this pore-forming protein they cannot egress efficiently from the erythrocytes, leading to a decrease in the parasite's fitness. Future assays aimed to evaluate transcription and expression of other PLPs in the Δplp1 strain, and the in vivo replication of this strain in experimental infections of cattle and ticks will allow to determine if PLP1 is necessary for the replication and development of other stages of B. bovis and to determine redundancy between PLP family members.
Citación:
---------- APA ----------
Paoletta, Martina Soledad. (2019). Estudio estructural y funcional de la familia de proteínas de tipo perforina en Babesia spp. y su rol en la interacción patógeno-hospedador.. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6950_Paoletta
---------- CHICAGO ----------
Paoletta, Martina Soledad. "Estudio estructural y funcional de la familia de proteínas de tipo perforina en Babesia spp. y su rol en la interacción patógeno-hospedador.". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2019.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6950_Paoletta
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