Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Identificación y caracterización de fuentes de resistencia genética a la Marchitez Anticipada causada por Verticillium dahliae en Girasol |
| Título alternativo: | Identification and characterization of genetic resistance sources to Sunflower Verticillium Wilt caused by Verticillium dahliae in sunflower |
| Autor: | Montecchia, Juan Francisco |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Instituto de Investigación Biotecnología
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| Fecha de defensa: | 2019-03-18 |
| Fecha en portada: | 18 de marzo de 2019 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Director: | Heinz, Ruth A.; Paniego, Norma B. |
| Consejero: | Hopp, H. Esteban |
| Jurado: | Bessaga, Ceciliaju; López, César C.; Balatti, Pedro |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | GIRASOL; VERTICILLIUM DAHLIAE; MAPEO DE QTL; MAPEO POR ASOCIACION; MAPEO DE LIGAMIENTO; MARCHITEZ; VERTICILOSISSUNFLOWER; VERTICILLIUM DAHLIAE; VERTICILLIUM WILT; QTL MAPPING; GENOME WIDE ASSOCIATION STUDIES; LINKAGE MAPPING |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6901_Montecchia |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6901_Montecchia.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6901_Montecchia |
| Ubicación: | Dep.BIO 006901 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Montecchia, Juan Francisco. (2019). Identificación y caracterización de fuentes de resistencia genética a la Marchitez Anticipada causada por Verticillium dahliae en Girasol. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6901_Montecchia |
Resumen:
En Argentina el cultivo de girasol ocupa actualmente una superficie cultivada de aproximadamente 1.7 millones de hectáreas. Siendo nuestro país el cuarto productor mundial de esta oleaginosa y el cuarto exportador al mercado mundial de su aceite. La expansión del cultivo de soja desde fines de la década del 90 ́ produjo el desplazamiento del cultivo de girasol a zonas con menor potencialidad productiva a causa de adversidades bióticas y abióticas que restringen los potenciales de rendimiento. Entre las adversidades bióticas de mayor preponderancia en Argentina, la marchitez y quebrado del tallo causada por Verticillium dahliae (Kleb.) (MV) representa una de las principales enfermedades del cultivo, principalmente por su carácter endémico y por su elevada prevalencia. Si bien el quebrado de tallos es un síntoma poco frecuente en híbridos comerciales actualmente, el marchitamiento anticipado del cultivo causa severas pérdidas de rendimiento que pueden ser elevadas en campos altamente infestados. El área endémica de la enfermedad abarca aproximadamente 1.200.000 hectáreas, entre el sur bonaerense y La Pampa, comprometiendo gran parte de la superficie total cultivada con girasol y la región donde se concentra el 70% de la producción total de la RA. La MV es una enfermedad vascular monocíclica, cuya fuente de inóculo está constituida por los microesclerocios formados por el hongo, los cuales conservan en suelo una viabilidad infectiva de 10 a 15 años, pudiendo infectar un amplio rango de hospedantes alternativos. El control químico de la enfermedad resulta ineficiente por no haber compuestos activos efectivos para su control en xilema. El manejo de la enfermedad se basa en el uso de híbridos resistentes o tolerantes y en la incorporación de cultivos no hospedantes a la rotación dentro del plan de siembras. Ante este panorama, adquiere especial relevancia por un lado la identificación de fuentes de resistencia genética a las variantes locales del patógeno y su localización genómica, y por el otro, la caracterización molecular del patógeno junto a la identificación de líneas endocriadas de girasol diferenciales a razas como base para desarrollar herramientas para el mejoramiento asistido. Estas herramientas permitirán avanzar en el desarrollo de genotipos con niveles de tolerancia/resistencia a MV que otorguen mayor estabilidad productiva. El presente plan de trabajo tiene por objetivo la caracterización molecular de las razas virulentas locales de V.dahliae y la búsqueda de fuentes de resistencia durable a la marchitez anticipada causada por el patógeno, a través de la identificación de loci para características cuantitativas complejas (QTL, del inglés Quantitative trait loci) mediante mapeo genético (MG) de una población biparental y el mapeo por asociación (MA) sobre una población no estructurada que tiene como base materiales del programa de mejoramiento de INTA. Estas poblaciones fueron caracterizadas fenotípicamente en ensayos multiambientales sobre infectarios naturales con alta carga y diversidad patogénica. En el periodo comprendido entre las campañas 2013/14 y 2017/18 se realizaron cuatro ensayos de desafío para la población biparental (140 Líneas recombinantes endocriadas) y cinco para la población de asociación (164 Líneas Endocriadas). Los ensayos fueron conducidos en el infectario natural de la EEA-INTA-Balcarce que cuenta con aislamientos de toda la región de cultivo de girasol del sur bonaerense. Alternativamente se realizaron ensayos en el infectario natural del criadero “El Cencerro” en Coronel Suárez. Las variables fenotípicas registradas fueron la incidencia y la severidad, relevadas regularmente a distintos estadios fenológicos a lo largo del ciclo del cultivo. Se emplearon modelos lineales mixtos y modelos lineales generalizados mixtos para ajustar las medias fenotípicas de los distintos genotipos para las variables estudiadas, a lo largo de la totalidad de ensayos. Paralelamente, para la caracterización molecular del patógeno se estudiaron cuatro aislamientos del cepario de la EEA-INTA Balcarce en base al reconocimiento de marcadores moleculares definidos internacionalmente como referencia para la especie y su virulencia en otros patosistemas. Ambas poblaciones de mapeo fueron genotipificadas usando la técnica de doble restricción enzimática para reducir la complejidad del genoma seguida por secuenciación de alto rendimiento. Para la población de asociación se obtuvo una matriz incompleta de más de 180 mil loci que luego de ser filtrada con criterios de calidad fue imputada mediante modelos probabilísticos para la predicción de datos faltantes, obteniéndose una matriz final completa de 18.161 mutaciones puntuales (SNP) distribuidos en los cromosomas de girasol. Las matrices completas de loci polimórficos fueron empleados para realizar estudios de estructura poblacional y desequilibrio de ligamiento y asociaciones fenotipo-genotipo. El análisis estadístico de las asociaciones se realizó usando la metodología de intervalos compuestos en MG y modelos lineales mixtos multilocus (MLMM) en MA, identificándose polimorfismos significativamente asociados con la reducción de los niveles de la enfermedad (p<0,05, corregido por comparaciones múltiples) para ambas variables. A partir de este trabajo se comprobó que las razas patogénicas locales de V. dahliae (VArg1 y VArg2) y la raza foránea E.E.U.U. son de tipo molecular raza 2 y se identificó un conjunto de seis líneas endocriadas de girasol capaces de diferenciarlas. En relación a la resistencia a la marchitez causada por Verticillium, por mapeo asociativo se identificaron 36 regiones genómicas distribuidas en 12 de los 17 cromosomas de girasol, portadoras de SNPs asociados estadísticamente a la resistencia a la enfermedad, que explicaron 5% o más de la varianza fenotípica para las variables a las que fueron asociadas. Mediante mapeo de ligamento se localizaron seis QTL, de los cuales tres coinciden con las regiones genómicas asociadas por mapeo de asociación validando la importancia de las mismas en la contribución a la resistencia a la enfermedad. Los resultados obtenidos demuestran la utilidad de la combinación de las estrategias de mapeo de QTL y de asociación para dilucidar la composición génica de caracteres complejos como el aquí estudiado. Dada la falta de estudios publicados que indaguen sobre la base genética de la resistencia a MV en girasol, el presente trabajo resulta pionero en su aproximación a la problemática y permitirá dirigir la selección de materiales de mejora a regiones cromosómicas específicas. Ello posibilitará también futuros estudios concernientes a la naturaleza y funcionalidad de los factores genéticos presentes en las regiones identificadas, así como su implicancia en mecanismos de resistencia de base amplia o raza-específica.
Abstract:
Nowadays in Argentina sunflower culturing area extends over more than 1.7 million hectares. Our country is the fourth producer worldwide of this oil-crop and also the fourth sunflower edible-oil exporter for the international market. The explosive expansion of soy-bean culturing area at the end of the 90 ́s, driven by the arrival of herbicide-resistant varieties, pushed the sunflower culturing region to areas with lower productive potential for this crop, due mainly to biotic and abiotic adversities that compromised yields. Among the most preponderant biotic adversities in Argentina for this oil-crop, Sunflower Verticillium Wilt and Stem Fracture (SVW) caused by the soil-borne fungal pathogen Verticillium dahliae (Kleb.) represents one of the most important diseases affecting sunflower. The importance of SVW lies in its endemic condition and its prevalence, occupying an extensive area of 1.2 million hectares covering the south of Buenos Aires and the east of La Pampa, where 70% of sunflower national production is grown. SVW is a monocyclic vascular disease whose inoculum source is constituted by microsclerotia produced by the fungus, which are able to stay infective in soil for periods of 10-15 years, being capable of colonize and infect a broad range of dicotyledonous alternative hosts. Even if the stem breakage is a seldom seeing symptom nowadays, due to the basal resistance that most of the hybrids used have, the wilting caused by SVW could have a strong impact on yield in fields highly infested. Fungicide control of SVW is not effective because active compounds fail in reaching the xylem vessels were the infection takes place. Thus, resistance breeding is a key strategy to cope with this affection. In this scenario, the finding of genetic resistance sources to cope with the local pathogenic races of the fungus, and their genomic localization in one hand, and the molecular characterization of these races together with the discovery of differential lines in the other hand, earn substantial relevance to assist breeding for the achievement of genetic resistant sunflower crops. This strategy will promote the development of SVW tolerant/resistant genotypes conferring production stability. The aim of the present study is to molecularly characterize the different races of V.dahliae and to identify genomic regions conferring stable and lasting resistance to Sunflower Verticillium Wilt, through the identification of quantitative trait loci (QTL) underpinning the architecture of this complex trait. The approach to that goal was boarded by two QTL mapping methods, Linkage Mapping (LM) on a bi-parental panel and through Association Mapping (AM) in a diversity panel that comprehends a collection of diverse genetic resources from the Sunflower Breeding Program of INTA. These two panels were phenotypically characterized in multi-environmental field-trials performed in highly infested inoculum natural reservoirs, harboring a wide range of isolates from the whole sunflower growing region. Between the 2013/14 and 2017/18 growing seasons nine field-trials were carried on, four for the bi-parental mapping panel (140 Recombinant Inbred Lines) and five for the Diversity Panel (164 Inbred Lines). Replicated field-trials were carried in the natural reservoir of EEA-INTA-Balcarce. Alternatively one field trial was performed in the natural reservoir of “El Cencerro” Seed Breeding Company, located at Coronel Suárez, Bs.As. The main phenotypic variables scored were disease incidence and severity, being assessed at different time points of the crop-growing cycle defined by phenological stages. Mixed Linear Models and Generalized Mixed Linear Models were implemented to adjust the phenotypic means corresponding to each inbred line across fieldtrials, for the variables scored for resistance assessment. In parallel, for the molecular characterization of the fungus, four isolates conserved in the V.dahliae bank of INTA-Balcarce were analyzed with four molecular markers deployed worldwide for species recognition and for virulence-group belonging in other pathosystems. Both mapping panels were genotyped using double digest restriction-site associated DNA for reduction of sunflower genome complexity, followed by high-throughput next generation sequencing. For the AM panel an incomplete matrix of 180 thousands loci was obtained. After being filtered by quality and frequency criteria, an imputation strategy of missing data was undergone applying probabilistic prediction models, rendering a full matrix of 18.161 single nucleotide polymorphisms (SNPs) distributed along sunflower chromosomes. This complete matrix of polymorphic loci was used to perform population structuring and linkage disequilibrium analysis for further genotype-phenotype association studies. The statistical associations were performed using Composite Interval Mapping Functions for LM and Multilocus Mixed Linear Models (MLMM) for AM. Significant associations were found with reduction of disease scores for both phenotypic variables (p<0.05, corrected for multiple comparison tests). Genomic regions of interest were found in chromosomes 5, 10 and 14, producing increases in SVW resistance by diminishing incidence levels, severity or both in some cases. This work allowed to conclude that the V. dahliae local races identified as VArg1 and VArg2, and the foreign race analyzed (USA), belong to the race type 2, lacking the Ave1 effector. Six differential lines were discovered to distinguish the three mentioned races. Considering genetic resistance to SVW, AM identified 36 genomic regions distributed on 12 chromosomes over the 17 of the sunflower genome. All of these regions contained statistically associated SNPs, explaining a 5% or more of the phenotypic variance of the variable to which they were associated. Linkage mapping on the RIL population allowed the validation of 3 regions associated previously by AM. The results achieved demonstrate the utility of complementing QTL mapping strategies for elucidating the genetic composition of complex traits like the one under study. Owing the lack of published studies investigating about the genetic constitution of Verticillium Wilt Resistance in sunflower, this research project becomes pioneer in this area for boarding this issue from a combined QTL mapping approach. Until now there is few association mapping studies in sunflower and none focused in SVW. The results obtained here will allow the development of new disease-resistance breeding strategies focalized on selection of specific genomic regions. In a future, studies concerning the nature and functionality of the genetic factors present in the identified regions could be undertaken, as well as the exploration of the factors conferring either broad or race-specific disease resistance.
Citación:
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Montecchia, Juan Francisco. (2019). Identificación y caracterización de fuentes de resistencia genética a la Marchitez Anticipada causada por Verticillium dahliae en Girasol. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6901_Montecchia
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Montecchia, Juan Francisco. "Identificación y caracterización de fuentes de resistencia genética a la Marchitez Anticipada causada por Verticillium dahliae en Girasol". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2019.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6901_Montecchia
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