Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Título: | Influencia de la topografía del sustrato en la formación de biofilms bacterianos. |
| Título alternativo: | Influence of surface topography on biofilms formation. |
| Autor: | Colonnella, María Antonela |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | CONICET. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman" (CIBION)
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| Publicación en la Web: | 2022-03-29 |
| Fecha de defensa: | 2020-03-26 |
| Fecha en portada: | 2020 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Director: | París, Gastón |
| Director Asistente: | Lizarraga, Leonardo |
| Consejero: | Zorreguieta, Ángeles |
| Jurado: | Yantorno, Osvaldo Miguel; Zelcer, Andrés; Pettinari, María Julia |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6818_Colonnella |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6818_Colonnella.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6818_Colonnella |
| Ubicación: | Dep.QUI 006818 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Colonnella, María Antonela. (2020). Influencia de la topografía del sustrato en la formación de biofilms bacterianos.. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6818_Colonnella |
Resumen:
Los biofilms son comunidades complejas de microorganismos que viven embebidos en una matriz polimérica. Ésta les provee resistencia frente a numerosas condiciones de estrés, les proporciona un ambiente estable y facilita la obtención de nutrientes. Las ventajas emergentes frente a la vida de forma libre, dificultan su eliminación y por ende, representan un problema tanto en la industriacomo en el área de la salud. Diversos estudios resaltan a la topografía de la superficie como una propiedad relevante en la adhesión bacteriana. Sin embargo, otros factores físico-químicos como la hidrofobicidad, carga o composición química también afectan la adhesión de las bacterias de manera menos clara, lo que conlleva a resultados experimentales conflictivos y a la dificultad de precisar el efecto de la topografía. El objetivo principal de esta Tesis fue variar sistemáticamente la topografía de la superficie de manera controlada para determinar la influencia de ésta en las distintas etapas de formación de biofilms. Con este fin, se elaboraron superficies micro-nano estructuradas con surcos controlados usando el método de oxidación a través de plasma de elastómeros de polidimetilsiloxano bajo estiramiento uniaxial. Se lograron superficies con topografía sinusoidal con λ en el rango de 0,4-5 μm, las cuales se caracterizaron según el tamaño de las ondas, la dureza y el ángulo de contacto. Posteriormente, se estudió la adhesión bacteriana sobre estas superficies utilizando Pseudomonas protegens Pf-5 y Bacillus subtilis 168 como bacterias modelos de bacterias Gram negativas y Gram positivas, respectivamente. A tiempos cortos para ambas especies, se observa un menor porcentaje de cubrimiento en los sustratos con ondas de 0,4 μm respecto a las superficies lisas. Sin embargo, luego de 3 horas aumenta significativamente la adhesión de P. protegens a esta superficie a diferencia de lo que ocurre con B. subtilis, donde se mantiene el efecto de inhibición respecto a la superficie Lisa Tratada con plasma. También, se estimó la viabilidad celular de las bacterias adheridas mediante una tinción con un kit de fluorescencia. Los resultados de este ensayo sugieren que en los tiempos estudiados, los sustratos con ondas de 0,4 μm podrían comprometer la envoltura celular de P. protegens pero no la de B. subtilis. Además, se determinaron las fuerzas de adhesión mediante espectroscopía de fuerza utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM) con el fin de evaluar si las variaciones en el porcentaje de cubrimiento se deben a diferencias en la magnitud de las fuerzas de adhesión bacteria-sustrato. Curiosamente, las fuerzas entre las bacterias y el PDMS No Tratado (hidrofóbico) fueron notablemente más grandes que aquellas que actúan entre el PDMS Liso Tratado con plasma (hidrofílico) o con las superficies estructuradas. Por lo tanto, mayores fuerzas de adhesión bacteria-sustrato no necesariamente favorecerían la colonización bacteriana siendo la topografía un factor clave en las primeras etapas de desarrollo de biofilms. A su vez, se cultivaron biofilms maduros mediante sistemas de crecimiento dinámico. Tras distintos tiempos de crecimiento, se visualizaron los biofilms mediante AFM en condiciones fisiológicas. Posteriormente, se comparó el módulo de elasticidad de los biofilms desarrollados sobre los diferentes sustratos. Los resultados preliminares muestran un aumento en la rigidez de los biofilms formados sobre las superficies estructuradas en comparación con aquellos que crecieron sobre los sustratos lisos. En conjunto, estos resultados ayudan a comprender cómo la topografía del sustrato influye en los distintos estadios de formación de biofilms de dos bacterias modelo.
Abstract:
Biofilms are complex microbial communities embedded into an extracellular polymeric substance (EPS). EPS provides resistance against varied stress conditions, mechanical stability and facilitates nutrien uptake. These emerging advantages over planktonic life make biofilms difficult to eliminate and therefore, they represent a problem both in industry and health area. Several studies highlight surface topography as a key factor in bacterial adhesion. However, other physicochemical parameters such as surface hydrophobicity, charge or chemical composition also affect the bacterial attachment in a rather unclear way resulting in conflictive experimental outcomes and making a precise determination of the effect of surface topography difficult. In this context, the main objective of this project was to systematically vary a single parameter - the surface topography – in a strongly controlled way to determine the influence of the topography on bacterial attachment and biofilm development. To this end, micro-nano structured surfaces with controlled wrinkles were made using the plasma oxidation method under uniaxial stretching of polydimethylsiloxane (PDMS). Surfaces with sinusoidal topography with λ in the range of 0.4-5 μm were obtained. Wave size, stiffness (Young's modulus) and contact angle were determined. Subsequently, bacterial adhesion was studied using Pseudomonas protegens Pf-5 and Bacillus subtilis 168 as Gram negative and Gram-positive bacteria, respectively. For both species after 1 hour, the coverage in substrates with 0.4 μm waves was significantly lower than in smooth surfaces. However, this effect is reverted after 3 hours for P. protegens where the highest amount of cells was measured in surfaces with λ=0.4 μm. In order to determine if structured surfaces have bactericidal activity, adhered cells were stained with LIVE/DEAD fluorescence kit and studied by wide field microscopy. These results suggest that substrates with 0.4 μm waves could compromise P. protegens envelope. In addition, adhesion forces were determined by force spectroscopy using an atomic force microscope (AFM) in order to assess whether changes between surfaces coverage are due to differences in the magnitude of bacterial-substrate adhesion forces. Interestingly, forces between bacteria and untreated PDMS (hydrophobic) were markedly higher than with smooth plasma treated PDMS (hydrophilic) and structured PDMS surfaces, suggesting that higher adhesion forces not necessarily favor bacteria colonization and that indeed topography play a key role on early steps of biofilms formation. In addition, mature biofilms were grown using dynamic growth systems and visualized by AFM under physiological conditions. Afterward, elasticity of biofilms developed on smooth and structured PDMS coupons was compared. Preliminary results showed a stiffer biofilm when developed on nano-structured surfaces compared to smooth coupons. These results contribute to elucidate how substrate topography influences the different stages of biofilm formation.
Citación:
---------- APA ----------
Colonnella, María Antonela. (2020). Influencia de la topografía del sustrato en la formación de biofilms bacterianos.. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6818_Colonnella
---------- CHICAGO ----------
Colonnella, María Antonela. "Influencia de la topografía del sustrato en la formación de biofilms bacterianos.". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2020.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6818_Colonnella
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