Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Caracterización biofisicoquímica de proteínas quinasas de Mycobacterium tuberculosis |
| Título alternativo: | Biophysical chemical characterization of Mycobacterium tuberculosis protein kinases |
| Autor: | Cabrera, Marisol Natalia |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Publicación en la Web: | 2022-03-29 |
| Fecha de defensa: | 2019-04-23 |
| Fecha en portada: | 2019 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Director: | Turjanski, Adrián Gustavo |
| Director Asistente: | Suárez, Sebastián Angel |
| Consejero: | Caramelo, Julio Javier |
| Jurado: | Parisi, Gustavo D.; Craig, Patricio O.; Lisa, María Natalia |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6689_Cabrera |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6689_Cabrera.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6689_Cabrera |
| Ubicación: | Dep.QUI 006689 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Cabrera, Marisol Natalia. (2019). Caracterización biofisicoquímica de proteínas quinasas de Mycobacterium tuberculosis. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6689_Cabrera |
Resumen:
La tuberculosis (TB) es un problema de salud a nivel mundial. Un millón y medio de personas al año mueren por esta enfermedad, siendo la primera causa de muerte entre los infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). El microorganismo causante de la enfermedad, Mycobacterium tuberculosis (Mtb.), es una bacteria de crecimiento lento que vive dentro de los macrófagos del hospedador, en donde puede residir por años sin producir síntomas, en un estado que se conoce como de latencia. Dentro del macrófago la mycobacteria se encuentra sometida a una serie de condiciones de estrés como hipoxia, falta de nutrientes y presencia de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ERON). Mtb posee varias estrategias que le permiten sobrevivir en dicho ambiente tan adverso. Las Ser/Thr quinasas son proteínas que han mostrado ser centrales para el control de diversos procesos celulares en una gran variedad de organismos. Es por ello que son reconocidas como importantes blancos farmacológicos para el tratamiento de diversas patologías, y más recientemente, para combatir enfermedades infecciosas como la tuberculosis. Las quinasas tienen un rol central en la cadena de transducción de señales y es por esto que su actividad está altamente regulada. Debido a la versatilidad del dominio quinasa, hay proteínas que han evolucionado mecanismos particulares para regular su actividad, como es el caso de la PknG de Mtb. PknG es una quinasa particular, ya que por un lado carece de loop de activación, y por otro tiene un dominio Rubredoxina (Rbx), un dominio pequeño con un centro metálico coordinado por 4 cisteínas, con interacción directa con el dominio quinasa. Se ha demostrado que PknG posee un rol clave tanto en la patogenia como en la regulación del ciclo de ácidos tricarboxílicos (TCA) y síntesis del glutamato. Se ha propuesto que esta regulación sería importante en el estado de latencia Mtb; de este modo, PknG estaría generando cambios metabólicos que permiten que el bacilo sobreviva dentro de los macrófagos. El mecanismo propuesto es que las ERON producidas dentro del macrófago serían “sensadas” por el dominio Rbx que a su vez funcionaría como un regulador de la actividad quinasa de PknG. Sin embargo esto no ha sido demostrado. El presente trabajo de tesis tiene como principal objetivo comprender los mecanismos de regulación (activación/inhibición) de la actividad quinasa de la serin treonin quinasa G (PknG) de Mtb, y se encuentra dividido en tres partes. Se sabe que esta quinasa regula al ciclo TCA y la síntesis de glutamato mediante la fosforilación de GarA. GarA es una proteína pequeña que posee como elemento de regulación dos treoninas susceptibles de ser fosforiladas: la Thr 21 y la Thr 22. Cuando GarA se encuentra sin fosforilar, interactúa e inhibe a las enzimas glutamato deshidrogenasa (GDH) y α -cetoglutarato descarboxilasa (KGD), y se une y activa la glutamina oxoglutarato aminotransferasa (GOGAT). KGD es una proteína central en el TCA, mientras que las otras dos regulan la síntesis del glutamato. PknG fosforila a GarA en el residuo 21, mientras que PknB, otra quinasa de Mtb, la fosforila en el residuo 22. Ambos eventos son específicos y excluyentes, y hasta el momento no se conoce el motivo de su especificidad, el cual fue estudiado a nivel atómico en la primera sección de esta tesis, mediante simulaciones computacionales y ensayos de actividad in vitro utilizando péptidos derivados de GarA. En la segunda parte, se realizó una caracterización fisicoquímica de PknG in vitro, para lo cual se caracterizó el centro metálico por técnicas de absorción y emisión molecular. Estos resultados han permitido determinar la presencia de Zn, Cd y Fe en el centro de Rbx. Posteriormente, se analizó la relevancia del metal unido en la actividad quinasa. Sumamente importante, en el caso de la proteína que posee hierro (el estado propuesto en Mtb), se analizó el efecto del estado de oxidación sobre la actividad de la misma. Para ello se hicieron estudios por técnicas espectroscópicas UV-VIS y Raman Resonante. Nuevamente se correlacionaron los resultados con las actividades medidas, observándose que el estado de oxidación (II) presenta la mayor actividad (similar a cuando posee Cd y Zn). En la tercera parte, se analizó la actividad de PknG en presencia de ERON, en particular NO, HNO/NOy H2O2. En estos caso pudimos observar que el poder de modular el estado de oxidación del hierro varía según la capacidad reductora/oxidante de las especies reactivas, y que el estado de oxidación del metal regula la actividad de PknG. Nuestros resultados en su conjunto permiten comprender que PknG es una proteína constitutivamente activa, que posee un sitio hidrofóbico de reconocimiento a sustrato bien diferente de PknB y cuya actividad quinasa es regulada por el estado de oxidación del centro metálico del dominio Rbx. Finalmente, pudimos determinar que la óxido/reducción puede ser mediada por ERON de interés fisiológico.
Abstract:
Tuberculosis (TB) remains a worldwide issue, 1.5 million people die from TB each year being the first cause of death among HIV infected people. The microorganism responsible for TB, Mycobacterium tuberculosis (MTb.), is a slow growing bacteria which lives inside host‘s macrophages where it can stay for years without causing symptoms to the host, in a state known as latency. Inside the macrophage, mycobacteria is exposed to a series of stressful conditions such as hypoxia, starvation or the presence of reactive oxygen and nitrogen species (RNOS). Mtb. has several strategies that allow him to survive in such an adverse environment. It has been shown that Ser/Thr kinases play a central role in the control of diverse cellular processes in a wide variety of organisms. That is why they are recognized as important pharmacological targets for the treatment of various pathologies, and more recently, to combat infectious diseases such as TB. Protein kinases have a central role in the signal transduction chain and this is why their activity is highly regulated. Due to the versatility of the kinase domain, there are proteins that have evolved particular mechanisms to regulate their activity, as is the case of the PknG Mtb protein. PknG is a particular kinase, since on the one hand it lacks an activation loop, and on the other it has a Rubredoxin domain (Rbx), a small domain with a metallic center coordinated by 4 cysteines, with direct interaction with the kinase domain. It has been shown that PknG has a key role both in the pathogenesis and in the regulation of the tricarboxylic acid cycle (TCA) and glutamate synthesis. It has been proposed that this regulation could be important in the Mtb. latency state, so PknG would be generating metabolic changes that allow the bacillus to survive inside the macrophages. The proposed mechanism is that the RNOS produced within the macrophage would be "sensed" by the Rbx domain which in turn would function as a regulator of the PknG kinase activity. However this has not been demonstrated. The main objective of this thesis is to understand the regulatory mechanisms (activation/inhibition) of the kinase activity of the serine threonine kinase G from Mtb. It is divided into three parts. It is known that this kinase regulates the TCA cycle and the synthesis of glutamate by the phosphorylation of GarA. GarA is a small protein that has as regulatory elements two phosphorylable threonines: Thr 21 and Thr 22. When GarA is unphosphorylated, it interacts and inhibits the enzymes glutamate dehydrogenase (GDH) and α-ketoglutarate decarboxylase (KGD), and activates glutamine oxoglutarate aminotransferase (GOGAT). KGD is a central TCA protein, while the other two regulate glutamate synthesis. PknG phosphorylates GarA at residue 21, while PknB, another kinase from Mtb, phosphorylates residue 22. Both events are specific and exclusive, and the reason for their specificity is unknown. In the first section of this thesis, through computational simulations and in vitro activity tests using GarA-derived peptides, we studied at the atomic level the reason for that specificity. In the second part, an in vitro physicochemical characterization of PknG was carried out. In this study we characterized the metal center by absorption and molecular emission techniques. These results have allowed us to determine the presence of Zn, Cd and Fe in the center of Rbx. Subsequently, the relevance of the bound metal in the kinase activity was analyzed. Extremely important, in the case of the protein that has iron (the state proposed in Mtb), we analyzed the effect of the oxidation state on the activity of the kinase. For this, we used UV-VIS and Resonant Raman spectroscopic techniques. Again, the results were correlated with the measured activities, observing that the oxidation state (II) has the highest activity (similar to the observed in the case of Zn or Cd). In the third part, the activity of PknG was analyzed in the presence of RNOS, in particular NO, HNO/NOand H2O2. In these cases we observed that the power to modulate the oxidation state of iron varies according to the reducing/oxidant capacity of the reactive species, and that the oxidation state of the metal regulates the activity of PknG. Together, this data allow us to understand that PknG is a constitutively active protein, which has an hydrophobic substrate recognition site and whose kinase activity is regulated by the oxidation state of the metallic center of the Rbx domain. Finally, we were able to determine that the oxidation/reduction can be mediated by RNOS of physiological interest.
Citación:
---------- APA ----------
Cabrera, Marisol Natalia. (2019). Caracterización biofisicoquímica de proteínas quinasas de Mycobacterium tuberculosis. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6689_Cabrera
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Cabrera, Marisol Natalia. "Caracterización biofisicoquímica de proteínas quinasas de Mycobacterium tuberculosis". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2019.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6689_Cabrera
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