Impacto de los progestágenos sobre la inmunovigilancia tumoral y los mecanismos de diseminación metastásica en cáncer de mama triple negativo

D'Alotto Moreno, Tomás

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Impacto de los progestágenos sobre la inmunovigilancia tumoral y los mecanismos de diseminación metastásica en cáncer de mama triple negativo
Título alternativo:	Progestins impact on tumor immunity and on the mechanisms involved in metastatic dissemination in triple-negative breast cancer
Autor:	D'Alotto Moreno, Tomás
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME)
Publicación en la Web:	2019-06-30
Fecha de defensa:	2017-03-30
Fecha en portada:	2017
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Director:	Salatino, Mariana
Consejero:	Calvo, Juan Carlos
Jurado:	Candolfi, Marianela; Ramhorst, Rosana E.; Novaro, Virginia
Idioma:	Español
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6523_DAlottoMoreno
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6523_DAlottoMoreno.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6523_DAlottoMoreno
Ubicación:	Dep.QUI 006523
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. D'Alotto Moreno, Tomás. (2017). Impacto de los progestágenos sobre la inmunovigilancia tumoral y los mecanismos de diseminación metastásica en cáncer de mama triple negativo. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6523_DAlottoMoreno

Resumen:

Alrededor del 14% de la población mundial de mujeres será diagnosticada con cáncer de mama en algún punto de su vida. Si bien, el diagnóstico y tratamiento temprano y la generación de nuevas y mejores terapias han contribuido significativamente a mejorar la sobrevida de las pacientes, una alta tasa de mortalidad aún persiste. La heterogeneidad tumoral, en lo que respecta a la agresividad y complejidad de los distintos subtipos de cáncer de mama, ha sido motivo de diversos estudios con el fin de dilucidar los mecanismos involucrados en la progresión tumoral y el desarrollo de novedosas terapias. El subtipo triple-negativo representa el tumor con peor pronóstico de sobrevida y con la menor cantidad y variedad de terapias disponibles en cáncer de mama. El rol de las hormonas femeninas en cáncer de mama ha sido estudiado durante muchos años, focalizándose principalmente en la contribución de los estrógenos. Sin embargo en los últimos años muchos estudios han señalado la relevancia de la progesterona en las características de esta enfermedad. La exposición a una alta concentración de esta hormona durante el embarazo o debido a terapias de suplementación hormonal se ha asociado a una mayor incidencia y malignidad de tumores mamarios. Los mecanismos involucrados en este efecto se asocian a la remodelación de la arquitectura normal y diferenciación de células de la glándula mamaria. Moléculas como IL-6, TNF y metaloproteinasas y componentes celulares como macrófagos parecen contribuir a este fenómeno. La participación de otras células del sistema inmune, como linfocitos, permanece inexplorada aunque algunos trabajos sugieren que las células T regulatorias podrían tener un rol en el desarrollo y malignidad de tumores de mama. En los últimos años se ha prestado particular atención a la contribución de receptor activator of NF-kb (RANK) ligand (RANKL), mediador clave en el desarrollo de la glándula mamaria, sobre la biología de las neoplasias mamarias. Ha sido demostrado que la expresión de RANKL inducida por progesterona favorece la incidencia de tumores de mama en ratones. Por otro lado se ha visto que las células T regulatorias (Tregs) que expresan RANKL se encuentran asociadas a neoplasias más agresivas. Sin embargo el rol directo de estas células T supresoras en la diseminación metastásica no ha sido demostrado. En este trabajo nos propusimos investigar el rol de los progestágenos sobre la progresión tumoral, focalizándonos en la regulación de la inmunidad tumoral y en la actividad protumoral de células T regulatorias Foxp3+. Utilizamos el modelo tumoral 4T1, que carece de receptores nucleares de Progesterona, Estrógenos y Her2, en ratones BALB/c que fueron tratados con progesterona, acetato de medroxiprogesterona (MPA) o norgestrel. Analizamos la composición y función de distintas poblaciones del sistema inmune en los ganglios drenantes (GD) y en el microambiente tumoral. Determinamos que los animales tratados con progestágenos presentaron una menor respuesta T efectora en los ganglios, con una menor proliferación antígeno-específica y producción de IFN-γ. La infiltración de estos tumores se caracterizó por una mayor presencia de linfocitos T CD8 PD-1+ TIM-3+ exhaustos. La inhibición de la respuesta inmune inducida por los progestágenos se vió acompañada de un incremento en la frecuencia y actividad de Tregs en el microambiente tumoral y en los GD. Determinamos que una mayor proporción de las Tregs presentes en los GD de animales tratados expresaban la molécula CD44, la cual identificó a una población más supresora, productora de mayores niveles de TGFβ-1 y mayor expresión de CTLA-4. A su vez, observamos que esta población expresaba el receptor de quemoquinas CXCR4 y era capaz de migrar más eficientemente in vitro. Estas observaciones sugieren que la progesterona participa de un circuito que promueve la generación de Tregs supresoras infiltrantes de tumor. La inmunosupresión asociada a los progestágenos no impactó sobre el crecimiento del tumor primario, sin embargo, indujo un aumento significativo de metástasis pulmonares. Estudiamos entonces la contribución del eje RANKL-RANK a la progresión tumoral regulada por progestágenos. Determinamos in vitro que la activación de esta vía por RANKL favorece la invasividad tumoral y la estabilidad de células madre tumorales (CSCs) CD44hi acompañada de un aumento de la fosforilación de Akt e Ikba. Asimismo, evaluamos si las células Tregs inducidas por progestágenos favorecían la agresividad de las células tumorales a través de la vía RANKL-RANK. En ensayos de cocultivo entre Tregs y células tumorales observamos una activación de Akt junto con un aumento en la estabilidad de CSCs, efecto que era dependiente de RANKL. Interesantemente, el cocultivo con Tregs favoreció la transición epitelio-mesenquimal de las células tumorales in vitro y una mayor capacidad metastásica in vivo en un ensayo de metástasis experimentales. La contribución de Tregs en la progresión tumoral se comprobó in vivo en animales DEREG, en los cuales la depleción de esta población redujo significativamente el número de metástasis pulmonares y suprimió el efecto de la progesterona. Por otro lado, el bloqueo in vivo de RANKL con un anticuerpo monoclonal redujo el número de metástasis. Los resultados presentados en este trabajo contribuyen a la comprensión de los mecanismos involucrados en la progresión metastásica inducida por progestágenos en cáncer de mama señalando la importancia de los procesos normales tanto en la remodelación de la glándula mamaria como en la progresión tumoral. A su vez, resaltan la participación de las células Tregs con una función novedosa y previamente no conocida como mediadores directos de la diseminación metastásica. Finalmente planteamos a RANKL como blanco terapéutico del cáncer de mama triple negativo no sólo como regulador de la remodelación del nicho óseo sino como inductor de la invasividad del tumor primario.

Abstract:

Around 14% of women worldwide will be diagnosed with breast cancer at some point in their lives. Even, when early diagnosis, treatment and the development of new and better therapies have contributed to the improvement of patient’s survival, a high mortality among breast cancer patients still persists. Tumor heterogeneity concerning the complexity and malignancy of the different breast cancer subtypes has motivated the study of the mechanisms involved in tumor progression and the development of novel therapies. Triple-negative breast cancer has one of the worst prognosis concerning overall survival rates and patients diagnosed with this lethal subtype have the fewest therapies available compared to other breast cancer subtypes. Female hormones have a critical role in breast cancer and their impact has been studied for many years, focusing mainly in the regulation of breast cancer initiation and promotion by oestrogen. In the last decade, however, many studies have highlighted the relevance of progesterone in shaping the outcome of the disease. Exposure to high concentrations of this hormone during pregnancy or as a consequence of hormone supplementation therapies has been associated to an increased incidence and malignancy of breast tumors. Progesterone directly affects remodelling of mammary gland architecture and cellular differentiation in both normal and pathological settings. This effect is poised to occur through interleukin-6, tumor necrosis factor and metalloproteases and involves cellular components of the immune system like macrophages. The participation of lymphocytes remains largely unexplored although some works suggest that regulatory T cells (Tregs) may play a key role in the development and aggressiveness of breast cancer. In the last few years a considerable amount of attention has been paid to receptor activator of NF-kb (RANK) ligand (RANKL), one key component of mammary gland development, and a main actor in mammary tumor biology. Progestin-induced expression of RANKL in mammary gland epithelial cells has been linked to an increase breast cancer incidence. Interestingly, RANKL-expressing Tregs have been associated to more aggressive lesions. However, the direct participation of these immune cells in tumor dissemination has not been established. In this work we investigated how progestins could affect tumor progression, focusing on the regulation of tumor immunity and the interaction with Foxp3+ Tregs. We used 4T1 mouse tumor model, which lacks progesterone and oestrogen receptors and Her2 expression and thus is considered to recapitulate human triple-negative breast cancer. We injected 4T1 tumor cells in female BALB/c mice that were treated with progesterone, medroxyprogesterone acetate (MPA), or norgestrel. We analysed the composition and function of different key immune cell populations in draining lymph nodes (LN) and in the tumor microenvironment. We determined that all animals treated with progestins exhibited a dampened effector T cell activity in LN, characterized by an inhibition in the proliferative response upon antigen restimulation and a decreased IFN-γ production. Analysis of tumor-infiltrating T cells showed a larger proportion of PD-1+TIM3+ exhausted CD8 T cells. The inhibition of tumor immunity induced by progestins was accompanied by an increment in the frequency and suppressive activity of Tregs in draining LN and in the tumor microenvironment. We observed a higher proportion of CD44-expressing Tregs among the Tregs population in the draining LN in animals treated with progestins. CD44 expression identified a population of Tregs with increased suppressive function, TGFβ-1 production and CTLA-4 expression. Concordantly, this population also presented a higher in vitro migratory capacity, which was dependant of CXCR4 expression. These observations suggest that progesterone and its derivatives act in a circuit that promotes the generation of suppressive Tregs that infiltrate the tumor, thus inhibiting tumor immunity. Immunosupression induced by progestins did not impact on the growth primary tumor. Nonetheless, hormone-treated animals presented a higher burden of metastatic lesions in the lungs. We decided to pinpoint the relevance of the RANKL-RANK axis on progestin-mediated tumor progression. We determined that activation of this signalling pathway favours tumor cell invasiveness and CD44hi cancer stem cells (CSCs) self renewal. RANKL treatment of tumor cells activated Akt and Iκba phosphorylation. We then evaluated if progestin-induced Tregs could promote cancer cells malignancy through activation of RANKL-RANK axis. When cocultured, Tregs stimulated Akt phosphorylation in cancer cells and CSCs stability in a RANKL-dependant manner. Tregs also induced a RANKL-mediated increase in cancer cells invasiveness both in vitro and in vivo. The contribution of Tregs to progestin-mediated tumor progression was confirmed using DEREG animals. Depletion of Tregs in these mice treated with progesterone drastically reduced the number of pulmonary lesions and suppressed the tumor-promoting effect of this hormone. Concordantly, antibody-mediated RANKL blockade also reduced the number of metastatic foci. These results contribute to the comprehension of the mechanisms involved in the metastatic progression, highlighting the relevance of normal mammary gland remodelling processes and their regulation by progestins. Additionally, we underscored the participation of Tregs and describe a novel function of these cells as key regulators of tumor dissemination. Finally, we have identified RANKL as a possible therapeutic target in triple-negative breast cancer treatment, pinpointing it as key regulator of cancer cell invasion.

Citación:

---------- APA ----------

D'Alotto Moreno, Tomás. (2017). Impacto de los progestágenos sobre la inmunovigilancia tumoral y los mecanismos de diseminación metastásica en cáncer de mama triple negativo. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6523_DAlottoMoreno

---------- CHICAGO ----------

D'Alotto Moreno, Tomás. "Impacto de los progestágenos sobre la inmunovigilancia tumoral y los mecanismos de diseminación metastásica en cáncer de mama triple negativo". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2017.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6523_DAlottoMoreno

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