Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Establecimiento de un modelo humano de neurodegeneración a partir de células pluripotentes diferenciadas a linaje neural en un contexto de sobreexpresión de alfa sinucleína |
| Título alternativo: | Establishment of a human neurodegeneration model from pluripotent cells differentiated to neural lineage in a over expression context of alpha synuclein |
| Autor: | Dimopoulos, Nicolás Alexis |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia (FLENI). Laboratorio de Investigación Aplicada a Neurociencias (LIAN)
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| Publicación en la Web: | 2019-04-30 |
| Fecha de defensa: | 2018-09-14 |
| Fecha en portada: | 2018 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Sevlever, Gustavo Emilio |
| Consejero: | Uchitel, Osvaldo Daniel |
| Jurado: | Kotler, Mónica L.; Setton de Avruj, Patricia; Goya, Rodolfo G. |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | ENFERMEDAD DE PARKINSON; NEURODEGENERACION; ALFA SIN; NEURONAS HUMANAS; CELULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS; CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS HUMANAS; MITOCONDRIA; TRANSPORTE MOTOCONDRIAL; FISION MITOCONDRIAL; BIODINAMICA MITOCONDRIAL; HOMEOSTASIS MITOCONDRIAL; EDICION GENICAPARKINSON'S DISEASE; NEURODEGENERATION; ALFA SYN; HUMAN NEURONS; HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS; HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS; MITOCHONDRIA; MITOCHONDRIAL TRANSPORT; MITOCHONDRIAL FISSION; MITOCHONDRIAL BIODYNAMICS; MITOCHONDRIAL HOMEOSTASIS; GENOMIC EDITION |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6494_Dimopoulos |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6494_Dimopoulos.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6494_Dimopoulos |
| Ubicación: | BIO 006494 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Dimopoulos, Nicolás Alexis. (2018). Establecimiento de un modelo humano de neurodegeneración a partir de células pluripotentes diferenciadas a linaje neural en un contexto de sobreexpresión de alfa sinucleína. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6494_Dimopoulos |
Resumen:
Las células pluripotentes humanas pueden ser de origen embrionario, (CMEH), o inducidas (CMPih). Sus características más atrayentes residen en su inagotable potencial proliferativo y su pluripotencia o capacidad de diferenciarse a tejidos pertenecientes a las tres capas germinales. Las CMEH están constituidas por una población de células derivadas del macizo celular interno del blastocisto de mamíferos. Las CMPih son células somáticas que han sido reprogramadas mediante la expresión ectópica de factores de transcripción fundamentales para el mantenimiento del estado indiferenciado (por ejemplo: Oct3/4; Sox2 con Klf4 y c-Myc o Nanog y Lin28) (KazutoshiTakahashi et al, 2007). Las CMPih una vez reprogramadas adquieren características de auto-renovación y capacidad de diferenciarse dando origen a células de las tres capas germinales. La capacidad de estas células pluripotentes para recapitular sistemas celulares humanos experimentalmente in vitro es alta y constituye una herramienta muy valiosa para el estudio tanto de los mecanismos moleculares que subyacen el desarrollo humano como de enfermedades neurodegenerativas o cardíacas entre otras. La proteína Alfasinucleina (αSin) es una proteína pequeña de 14 KDa altamente desorganizada de localización ubicua en el citosol y en las terminales sinápticas de las neuronas. En condiciones normales es soluble, pero en concentraciones elevadas, frente a cambios en el pH, ocambios en los niveles intracelulares de Ca2+se agrega produciendo neurofilamentos conocidoscomo cuerpos de Lewy. Dichos agregados se han observado en formas esporádicas y hereditarias de la Enfermedad de Parkinson (EP), así como en la demencia de Lewy. En el presente trabajo se utilizaron células pluripotentes diferenciadas a neuronas como plataforma para el modelaje de la sobre-expresión de αSin wt y 2 mutantes asociados a la EP Familiar. El análisis del impacto de este tratamiento sobre los cultivos celulares utilizados se centró en la evaluación de la homeostasis mitocondrial en un contexto de sobreexpresión en contraste con el control no tratado. El enfoque sobre la mitocondria se debe a que existen múltiples genes asociados con la EP que convergen en el mantenimiento de la homeostasis de dicha organela como un factor etiológico crucial en la iniciación y el desarrollo temprano de la enfermedad. Los parámetros analizados fueron morfología, estado redox, transporte y biodinámica mitocondrial. Se logró utilizar exitosamente células pluripotentes humanas diferenciadas como modelo neuronal humano, proveyendo evidencia novedosa del impacto de la sobreexpresión de αSin sobre la homeostasis mitocondrial neural. Estos efectos están asociados, por un lado, a las mutaciones presentes en las variantes estudiadas, así como a los niveles de expresión y localización de la proteína respecto a la mitocondria. Asimismo, hemos probado que la fisión mitocondrial dependiente de αSin requiere de una interacción directa entre la proteína y/o agregados de la misma con la membrana externa mitocondrial. Determinamos además que la interacción de αSin con membranas mitocondriales depende en gran parte de su secuencia N-terminal, ya que la disrupción de dicho dominio en el gen de αSin endógeno por edición génica CRISPR-Cas9 indujo cambios en la morfología y biodinámica mitocondrial en las neuronas derivadas a partir de la línea celular editada, lo que soporta un rol fisiológico de la proteína dependiente de su dominio N-terminal. El rol fisiológico y patológico de αSin en la homeostasis mitocondrial axonal evidenciado, aporta al objetivo de un camino etiológico común subyacente a la patología de la EP, que en última instancia es fundamental para el entendimiento de las enfermedades neurodegenerativas y es una herramienta muy útil para el diseño de estrategias terapéuticas y/o preventivas para el tratamiento de las mismas.
Abstract:
Human pluripotent cells can have several origins; they can be embryonic (hESC) or induced (hiPSC). Their most appealing features reside in their limitless capacity to self-renewand their pluripotency, or their ability to differentiate into cells from the three germinal layers. The hESCs are derived from the inner blastocyst massif ofmammals. hiPSCs are somatic cells that underwent reprogramming by the ectopic expression of transcription factors that act as master genes controlling the undifferentiated state (e.g.:Oct3/4; Sox2 con Klf4 y c-Myc o Nanog y Lin28) (Kazutoshi Takahashi et al, 2007). Once reprogrammed, the hiPSCs acquire characteristics that resembles the proliferative and pluripotent nature of an embryonic stem cell. The ability of these pluripotent cells, to experimentally model human cell systems in vitro is high. Mainly due to the straight forward homology with its study object and the possibility of modeling cellular types that cannot be cultured as primary cultures from adult human tissue, such is the case for human central nervous system tissues and human cardiomyocytes. Alpha synuclein (αSyn) is a small protein of 14 KDa, inherently disorganized, and ubiquitously found in both cytosol and synaptic termini of neurons. In physiological conditions, it remains soluble, but when present in high concentration and faced with sudden changes in cellular pH or against changes in intracellular Ca2+ levels, it aggregates and produces neurofilaments known as Lewy Bodies. Those aggregates have been observed in sporadic and familial forms of Parkinson’s Disease (PD) as well as in Lewy’s Dementia. In this work, neurons derived from pluripotent human cells were used as a novel platform to model the overexpression of αSyn wt and 2 mutants associated with familial PD. The analysis of the impact of such treatment on the chosen cellular cultures focused on the evaluation of mitochondrial homeostasis in an αSyn overexpression context when compared with the untreated control. Our group focused on the mitochondria as our main focal point, since there are multiple genes associated with PD that converge in that organelle as a key etiological factor, crucial in the initiation and early development of the disease. To achieve this, we analyzed the following parameters: mitochondrial morphology, oxidative state transport, and biodynamics. We have managed to successfully use differentiated pluripotent human stem cells as a human neural model, providing novel evidence of the αSyn overexpression over neural mitochondrial homeostasis. These effects are associated, both to the mutations present in the studied variants, as well as the expression level and localization of the protein regarding the mitochondria. More so, we have proven that αSyn dependent mitochondrial fission requires the direct interaction of the protein or aggregates of it with the mitochondrial outer membrane. Our group also determined that the interaction between αSyn and mitochondrial membranes largely depends on its N-terminal sequence, since the disruption of that domain in the endogenous αSyn gene by genomic edition using CRISPR-Cas9 induced changes in both mitochondrial morphology and biodynamics within the neurons derived from the edited cell line, which supports the notion of a physiological role for the protein dependent on its N-terminal domain. The evidenced physiological and pathological role of αSyn in the maintenance of axonal mitochondrial homeostasis, contributes to a common underlying path to PD pathology, which ultimately is fundamental for the understanding of neurodegenerative diseases and is both a useful and powerful tool for the design of therapeutic and/or preventive strategies for the treatment of such ailments.
Citación:
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Dimopoulos, Nicolás Alexis. (2018). Establecimiento de un modelo humano de neurodegeneración a partir de células pluripotentes diferenciadas a linaje neural en un contexto de sobreexpresión de alfa sinucleína. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6494_Dimopoulos
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Dimopoulos, Nicolás Alexis. "Establecimiento de un modelo humano de neurodegeneración a partir de células pluripotentes diferenciadas a linaje neural en un contexto de sobreexpresión de alfa sinucleína". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2018.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6494_Dimopoulos
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