Efecto de la modulación del receptor de glucocorticoides sobre la progresión del cáncer de próstata

Leonardi, Daiana Beatriz

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Efecto de la modulación del receptor de glucocorticoides sobre la progresión del cáncer de próstata
Título alternativo:	Effect of glucocorticoid receptor modulation in prostate cancer progression
Autor:	Leonardi, Daiana Beatriz
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	INSTITUTO DE QUIMICA BIOLOGICA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES (IQUIBICEN). Laboratorio de Inflamación y Cáncer
Publicación en la Web:	2018-08-16
Fecha de defensa:	2017-11-24
Fecha en portada:	2017
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Director:	Vazquez, Elba Susana
Director Asistente:	Cotignola, Javier Hernán
Consejero:	Correa García, Susana
Jurado:	Simian, Marina; Galigniana, Mario D.; Novaro, Virginia
Idioma:	Español
Tema:	biología/biología molecular y celular
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6299_Leonardi
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6299_Leonardi.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6299_Leonardi
Ubicación:	Dep.QUI 006299
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Leonardi, Daiana Beatriz. (2017). Efecto de la modulación del receptor de glucocorticoides sobre la progresión del cáncer de próstata. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6299_Leonardi

Resumen:

El cáncer de próstata (CaP) es la segunda causa de muerte por cáncer entre los hombres occidentales y una de las estrategias terapéuticas actualmente utilizadas es la ablación de andrógenos. Sin embargo esta terapia resulta ineficaz en los estadios avanzados de los tumores, cuando se vuelven refractarios al tratamiento (cáncer de próstata resistente a la castración o CRPC). Entre las varias opciones terapéuticas para el CRPC, se pueden utilizar los glucocorticoides (GC) porque tienen un efecto inhibitorio parcial sobre la producción de andrógenos por la glándula adrenal. Los GC se han usado en el tratamiento del CaP para retardar la progresión de la enfermedad y controlar el dolor y los efectos colaterales de la terapia. Sin embargo, estos compuestos tienen el potencial de estimular el crecimiento del CaP vía el receptor de andrógenos (AR) mutado o el mismo receptor de glucocorticoides (GR). Hemo oxigenasa-1 (HO-1) es la enzima limitante en la degradación del grupo hemo y tanto su expresión como actividad pueden ser inducidas de forma específica por Hemina. En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos que la sobreexpresión de HO-1 en líneas de CaP disminuye su proliferación, invasión y migración in vitro y el crecimiento tumoral y angiogénesis in vivo. Además, reportamos que HO-1 inhibe la actividad transcripcional del receptor de andrógenos en el CaP interfiriendo con la vía de STAT3. En este trabajo de tesis nos propusimos evaluar la vía de GR y su modulación por HO-1, e identificar los procesos celulares alterados que median la progresión del CaP. Para ello realizamos los siguientes tratamientos: Hemina (80 μM, 24 h), Dexametasona (1x10-8 M, 6 h), la combinación de ambas drogas o PBS como control. Observamos que el tratamiento con Dexametasona no modificó la viabilidad de las líneas celulares PC3 (AR-/GR+) y C4-2B (AR+/GR+), mientras que el cultivo en presencia de Hemina disminuyó la viabilidad. En ambas líneas, además de corroborar que Hemina aumentaba la expresión génica (p<0,05) y los niveles proteicos de HO-1, se comprobó que reducía significativamente la expresión de NR3C1 (gen codifica para GR; p<0,01) y afectaba la expresión de distintos genes blanco de GR. El tratamiento con Dexametasona indujo los niveles de GR en ambas líneas celulares. Mediante ensayos con genes reporteros evidenciamos que Dexametasona aumentaba la actividad transcripcional de GR (p<0,01). Sin embargo, en la línea PC3 este efecto fue revertido parcialmente por el pre-tratamiento con Hemina (p=0,02). También, observamos que HO-1 y GR co-inmunoprecipitaban tanto en núcleo como en citoplasma. Por inmunofluorescencia, pudimos ver que la presencia de Dexametasona aumentó la localización nuclear de GR; sin embargo, en el pre-tratamiento con Hemina el receptor quedó parcialmente retenido en el citoplasma (p=1x10-7). Al estudiar laexpresión proteica de las inmunofilinas FKBP51 y FKBP52, se observó un aumento significativo de FKBP51 en las células tratadas con Hemina+Dexametasona, lo que podría explicar la retención parcial en citoplasma de GR en estas condiciones. Por análisis bioinformático no se hallaron elementos de respuesta a GR en el gen HMOX1. Dado el alto índice de metástasis óseas en el CaP, células PC3 pre-tratadas o no con Hemina, se co-cultivaron con la línea MC3T3 (preosteoblastos murinos). Observamos que el co-cultivo aumentó la expresión de NR3C1 tanto en las células tumorales como en las progenitoras óseas. Con el objetivo de analizar el efecto de los tratamientos con Hemina y Dexametasona in vivo, generamos tumores s.c. de células PC3 creciendo como xenotransplantes en ratones nude. Cuando los tumores alcanzaron un volumen aproximado de 150 mm3, los animales se inyectaron i.p. cada 48 h con 6 dosis de los siguientes tratamientos: Hemina (25 mg/kg), Dexametasona (0,2 mg/kg), Hemina+Dexametasona (misma dosis tratamientos individuales) o PBS (control). Los animales fueron sacrificados 24 h luego de la última dosis. Observamos que la administración i.p. de Hemina en ambos tratamientos muestra una tendencia hacia el aumento del crecimiento tumoral, mientras los tumores de ratones tratados con Dexametasona sola crecieron de forma similar a los del grupo control. Sin embargo, las diferencias no resultaron significativas probablemente debido al número limitado de animales incluidos (n=7 por grupo). El estudio de la expresión de HO-1 y GR por inmunohistoquímica reveló la ausencia de marcación para HO-1 en los tumores de todos los grupos y tinción positiva de HO-1 en los macrófagos infiltrantes al tumor. Para GR se observó una fuerte inmunorreactividad nuclear en los tumores de los grupos Hemina y Dexametasona. Al analizar lisados tumorales totales por Western Blot, se comprobó que la administración de Dexametasona sola o conjuntamente con Hemina causó un aumento significativo de HO-1. A nivel génico, se observó una disminución significativa en la expresión de NR3C1 en los tumores tratados con Dexametasona respecto a los controles (p=0,02), sin evidenciarse cambios en los niveles de HMOX1. Con el objetivo de estudiar la expresión de HMOX1 y NR3C1 en tumores humanos, utilizamos datos de RNAseq obtenidos de repositorios públicos. Los análisis revelaron que los pacientes con alta expresión de ambos genes presentan menor sobrevida libre de enfermedad y de recaída que aquellos pacientes que expresan niveles bajos.

Abstract:

Prostate cancer (CaP) is the second cause of cancer-related deaths among occidental men and one of the therapeutic strategy currently used is androgen deprivation. However, this therapy is not efficient in advanced tumours, when they become treatment refractory (castration resistant prostate cancer or CRPC). Among the many therapeutic options for CRPC, glucocorticoids (GC) are usually used because of their partial inhibitory effect on adrenal androgen synthesis. GC have been used in CaP to delay its progression and to control therapy-related pain and side effects. Nevertheless, this drugs are able to stimulate CaP growth via mutated androgen receptor (AR) or glucocorticoid receptor (GR). Heme oxygenase-1 (HO-1) is the limiting rate heme degradation enzyme, and its expression and activity can be specifically induced by Hemin. In previous reports from our group we showed that HO-1 overexpression in CaP cell lines can reduce proliferation, invasion and migration in vitro and, tumor growth and angiogenesis in vivo. We also reported that HO-1 inhibits AR transcriptional activity in CaP by interfering in STAT3 signalling. In this thesis, we studied GR signalling pathway and its modulation by HO-1, to identify the altered cellular processes that lead to CaP progression. Therefore, we performed the following treatments: Hemin (80 μM, 24 h), Dexamethasone (1x10-8 M, 6 h), the combination of both drugs or PBS as control. We found that Dexamethasone did not affect the viability of the cell lines PC3 (AR-/GR+) or C4-2B (AR+/GR+), while the presence of Hemin reduced this parameter. In both cell lines we confirmed that Hemin treatment increased HO-1 gene expression (p<0.05) and protein levels. We also demonstrated that Hemin significantly reduced NR3C1 levels (p<0.01; encodes for GR) and affected the expression of different GR downstream targets. In both cell lines Dexamethasone treatment induced GR levels. Using reporter genes assays we showed that Dexamethasone significantly increased GR transcriptional activity (p<0.01). However, this effect was partially reverted by Hemin pre-treatment in PC3 cells (p=0.02). We observed that HO-1 and GR co-immunoprecipitated in the nucleus and in the cytoplasm. We showed that Dexamethasone treatment increased GR nuclear localization using immunofluorescence microscopy; while Hemin pre-treatment partially abolished GR nuclear translocation (p=1x10-7). When immunophilins FKBP51 and FKBP52 were studied, we evidenced a significant increase of FKBP51 protein level in Hemin+Dexamethasone treated cells, and this could possibly account for the partial GR cytoplasmic retention under this experimental condition. No GR response element was found in HMOX1 gene using bioinformatics. Given that CaP usually metastasize to bone, PC3 cells pre-treated or not with Hemin were co-cultured with MC3T3 cells (murine preosteoblastic cell line). We observed that co-culture augmented NR3C1 levels in both tumour and bone progenitor cells. Aiming to study the effect of Hemin and Dexamethasone treatment in vivo, we generated s.c. PC3 tumours growing as xenografts in nude mice. When tumours reached a volume around 150 mm3, the animals were i.p. injected every 48 h with 6 doses of the following treatments: Hemin (25 mg/kg), Dexamethasone (0.2 mg/kg), Hemin+Dexamethasone (same doses that individual treatments) or PBS (control). The animals were sacrificed 24 h after the last dose. We observed that i.p. Hemin administration seemed to increase the tumour growth, while those treated with Dexamethasone alone grew similarly to controls. However, there were no significant differences probably due to the limited number of animals included (n=7 per group). By immunohistochemistry analysis, we demonstrated no positive staining for HO-1 in tumours, but high HO-1 reactivity was detected in macrophages infiltrating the tumours. High nuclear immunoreactivity for GR was observed in Hemin and Dexamethasone treated tumours. The analysis of total tumour lysates by Western Blot, revealed HO-1 levels significantly increased in animals treated with Dexamethasone. Further at the transcription level, we observed reduced expression of NR3C1 in those tumours treated with Dexamethasone (p=0.02), with no changes in HMOX1 levels. To study NR3C1 and HMOX1 expression in human tumours, we used RNAseq data from public repositories. The analyses showed that patients expressing high levels of both genes have lower disease-free survival and lower relapse-free survival than those patients that express low levels. In summary, our in vitro and in vivo results suggest an association and a possible modulation between HO-1 and GR pathways.

Citación:

---------- APA ----------

Leonardi, Daiana Beatriz. (2017). Efecto de la modulación del receptor de glucocorticoides sobre la progresión del cáncer de próstata. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6299_Leonardi

---------- CHICAGO ----------

Leonardi, Daiana Beatriz. "Efecto de la modulación del receptor de glucocorticoides sobre la progresión del cáncer de próstata". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2017.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6299_Leonardi

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