Caracterización de las proteínas codificadas por el Cotton leafroll dwarf virus y de un clon infectivo del virus

Delfosse, Verónica Cecilia

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	biologia
Título:	Caracterización de las proteínas codificadas por el Cotton leafroll dwarf virus y de un clon infectivo del virus
Título alternativo:	Characterization of the cotton Leafroll dwarf virus encoded proteins and a cDNA infectious clone
Autor:	Delfosse, Verónica Cecilia
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Publicación en la Web:	2022-03-29
Fecha de defensa:	2017-04-12
Fecha en portada:	2017
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Director:	Distéfano, Ana Julia
Consejero:	Hopp, H. Esteban
Jurado:	Heinz, Ruth; Scolaro, Luis; García, María L.
Idioma:	Español
Palabras clave:	ENFERMEDAD AZUL DEL ALGODON; CLRDV; CLON INFECTIVO; PROTEINA PO; SILENCIAMIENTO DEL RNA; INTERACCION DE PROTEINAS VIRALESCOTTON BLUE DISEASE; CLRDV; FULL-LENGTH CDNA; PO PROTEIN; RNA SILENCING; VIRAL PROTEIN INTERACTIONS
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6229_Delfosse
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6229_Delfosse.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6229_Delfosse
Ubicación:	Dep.BIO 006229
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Delfosse, Verónica Cecilia. (2017). Caracterización de las proteínas codificadas por el Cotton leafroll dwarf virus y de un clon infectivo del virus. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6229_Delfosse

Resumen:

El algodón (Gossypium spp.) es un cultivo regional económicamente clave en el noreste argentino, cubriendo en la actualidad 500.000 hectáreas. La enfermedad azul es la principal enfermedad viral del algodón y causa importantes pérdidas en el cultivo si no se implementan medidas adecuadas de control consistentes en la siembra de cultivares resistentes a la enfermedad y en el control de los insectos vectores mediante insecticidas. La enfermedad es producida por el cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), una especie dentro del género Polerovirus de la familia Luteoviridae. Los síntomas característicos de la enfermedad son enanismo, enrollamiento de las hojas, textura coriácea con coloración verde oscura‐azulada y clorosis en las nervaduras. El virus es transmitido en forma circulativa y no propagativa por el pulgón del algodón Aphid gossypii, no siendo posible su transmisión mecánica. El CLRDV posee un genoma de RNA de simple cadena (ssRNA) positiva de 5,866 kb. El genoma de los virus pertenecientes al género Polerovirus está formado por siete marcos abiertos de lectura (ORFs). Los ORFs 0, 1 y 2 se traducen a partir del RNA viral dando como producto las proteínas P0, P1 y la proteína P1‐P2 a partir de un cambio de marco traduccional. La proteína P0 corresponde en algunos virus del género al supresor del silenciamiento génico, las proteínas P1 y P1‐P2 serían componentes de la RNA polimerasa dependiente de RNA. Los ORFs 3, 3a, 4 y 5, se traducen a partir de un RNA subgenómico, dando lugar a las proteínas P3, P3a, P4 y P3‐P5. La proteína P3 corresponde a la cápside viral, P3a y P4 corresponderían a las proteínas de movimiento viral y P3‐P5 al dominio readthrough de la proteína de cápside que estaría implicada en la transmisión del virus por el insecto vector. En los programas de mejoramiento del cultivo de algodón, la selección de variedades de algodón con resistencia genética a la enfermedad azul se realiza mediante la infección de las plantas con insectos vectores que son criados en el laboratorio y que poseen el virus. En el presente trabajo se construyó y caracterizó un clon infectivo de cDNA del CLRDV. Este sistema permitió desarrollar una estrategia alternativa de infección mediante la inoculación del virus vía agroinfección, independizándose de la transmisión por el insecto vector, y por otro lado es esencial para el desarrollo de un sistema de genética reversa que permita el estudio de la expresión y función de los genes virales, de la replicación del virus y la interacción plata‐virus a nivel molecular. Se caracterizó el clon infectivo del virus mediante ensayos de agroinfección en plantas de G. hirsutum NC33B (variedad susceptible a la infección por CLRDV). Se registró la aparición de síntomas típicos de la enfermedad en las plantas bajo estudio y se confirmó la infección a distintos tiempos postinfiltración en las hojas sistémicas mediante las técnicas de RTPCR, Northern y Western blot. A su vez, se demostró la transmisibilidad del virus desde plantas agroinfiltadas hacia plantas sanas mediada por áfidos, corroborando así que las partículas virales producidas por la agroinfección son infectivas y transmisibles por el vector natural. Además, se agroinfiltraron plantas de G. hirsutum variedad Guazuncho 2 (resistentes a la infección por CLRDV) y se comprobó que el virus no logra infectar esta variedad. Realizando el mismo tipo de ensayos, se comprobó que el clon infectivo del CLRDV tiene la capacidad de infectar las plantas modelo Arabidopsis thaliana y Nicotiana benthamiana. Si bien en ambas especies los ensayos moleculares demostraron la infección y la movilidad del virus sistémicamente, solo se observaron síntomas (clorosis internerval) en N. benthamiana. El estudio y la caracterización del clon infectivo de CLRDV permitieron desarrollar una técnica más sencilla de infección, que actualmente se está utilizando como sistema de infección de rutina en el programa de mejoramiento de algodón del INTA para la selección de germoplasma resistente a CLRDV. Para la caracterización de las proteínas CLRDV, se estudiaron las interacciones entre proteínas virales mediante el sistema de doble híbrido en levaduras. Se detectó interacción entre la proteína de cápside viral (P3) entre sí y con la proteína minoritaria de capside P3P5 y además se observó interacción de la proteína de movimiento (P4) entre sí. El silenciamiento génico constituye un mecanismo de defensa antiviral en plantas desencadenado por el RNA doble cadena. Como mecanismo de contra defensa, la mayoría de los virus vegetales poseen proteínas con función supresora del silenciamiento. Con el fin de avanzar en la comprensión de las bases moleculares de la enfermedad se investigó si el CLRDV posee una proteína capaz de suprimir el silenciamiento génico. Para ello se utilizaron dos sistemas basados en el silenciamiento de la proteína GFP, que permiten describir el mecanismo de acción y la etapa en la vía del silenciamiento que estaría afectada por el supresor. Estos estudios permitieron determinar que la proteína P0 del CLRDV es un supresor de silenciamiento local, que actúa bloqueando la vía del silenciamiento río arriba del proceso de amplificación. A su vez, no es capaz de inhibir la síntesis de RNAs pequeños (siRNAs) a partir de RNA de doble cadena ni es capaz de bloquear la movilidad sistémica de la señal de silenciamiento. Utilizando los mismos sistemas de silenciamiento se probó la actividad supresora del silenciamiento del clon infectivo de cDNA del CLRDV y se observó que la proteína P0 expresada en el contexto viral conserva la misma actividad supresora. Mediante un software de predicción se identificaron las proteínas P3 y P4 del CLRDV como otros potenciales supresores del silenciamiento génico postranscripcional, y se analizó su actividad de la misma forma que fue evaluada la proteína P0, pero estas proteínas no presentaron actividad supresora del silenciamiento en ninguno de los sistemas utilizados. Además, se evaluó comparativamente la virulencia de la proteína P0 del CLRDV y la proteína P0 del Cotton leafroll dwarf virus‐at (CLRDV‐at). Este virus es una variante nueva del CLRDV que quiebra la resistencia del germoplasma local estableciendo una infección suave con síntomas diferentes a enfermedad azul. Para ello se estudió la virulencia de P0 en el contexto de la infección de un virus heterólogo. Se analizó la exacerbación de los síntomas de PVX en presencia de las proteínas P0 en plantas de N. benthamiana. Se observó que la construcción PVX‐P0^CLRDV desarrollaba síntomas severos con respecto al PVX salvaje y el PVX^P0CLRDV-at desarrollaba síntomas suaves, mostrando que P0^CLRDV presenta mayor virulencia que P0^CLRDV-at. Según se describe en bibliografía la proteína P0 de algunos polerovirus interactúan con la proteína ASK1 del sistema SCF ubiquitina ligasa. Al interaccionar con dicho complejo median la degradación de la proteína ARGONAUTA 1 (AGO1) de la vía de silenciamiento génico de la planta. Utilizando la técnica de doble hibrido en levaduras se determinó que la proteína P0 del CLRDV también interacciona con el sistema SCF ubiquitina ligasa. Para ello se evaluó la interacción de las proteínas ASK de A. thaliana y sus correspondientes ortólogos: SKP1 de N. benthamiana y GSK1 de Gossypium hirsutum. Se determinó que la proteína P0 es capaz de interaccionar con SKP1 y GSK1, pero no fue posible determinar su interacción con ASK mediante la técnica utilizada. Estudios previos indican que la interacción entre la proteína P0 y ASK ocurre a través del dominio F‐box (LPXXL/IX_10-13P) de la proteína P0. Con el objetivo de determinar si la interacción con el sistema SCF ubiquitina ligasa de la proteína P0 del CLRDV es dependiente de la conservación del dominio F‐Box se realizaron mutantes en la región consenso del dominio. A partir del dominio F‐box de P0^CLRDV (LPFIIX_10P) se desarrollaron las mutantes P0^mut1 (LPFIvX_10P), P0^mut2 (aaFIIX_10a) y P0^mut3 (aaFIIX_10P). Teniendo en cuenta la secuencia del P0^CLRDV-at (LPFLvX_10P) se desarrolló el mutante P0^mut1 sobre la secuencia del P0^CLRDV y el mutante P0^mut4 (LPFLiX_10P) sobre la secuencia del P0^CLRDV-at. Se analizó la actividad supresora de los mutantes en el dominio mediante ensayos basados en el silenciamiento de la proteína GFP, en los cuales los mutantes P0^mut2 y P0^mut3 perdieron completamente la actividad supresora mientras que los mutantes P0^mut1 y P0^mut4 conservaron su actividad supresora con una leve variación en las intensidades de supresión. Mientras P0mut1 disminuyó su actividad respecto de P0^CLRDV, P0^mut4 la aumentó respecto de P0^CLRDV‐at. Consistente con los resultados in planta las mutantes P0^mut2 y P0^mut3 perdieron la interacción con las proteínas SKP1 y GSK1 en el sistema de doble híbrido en levaduras, mientras que P0^mut1 y P0^mut4 conservaron la capacidad de interaccionar con ellas. Estos resultados indican que la conservación del consenso LP de dicho dominio es indispensable para que ocurra la interacción y para que la proteína P0 posea su actividad supresora. Por último, mediante ensayos de coagroinfiltración de las proteínas P0 y AGO1, se logró determinar que en presencia de la proteína P0 la proteína AGO1 es degradada. De esta manera se confirmó que el mecanismo de acción de la proteína P0^CLRDV es conservado respecto de otras proteínas P0 caracterizadas previamente. A su vez, aquellos mutantes que perdieron su capacidad supresora tampoco fueron capaces de inducir la degradación de AGO1 señalando que el dominio F‐box está implicado en el mecanismo de patogenicidad de la proteína P0. Finalmente, se analizó la localización subcelular de la proteína P0 mediante la expresión de P0 fusionada a GFP. Mediante microscopía confocal se determinó que la proteína P0 se localiza en citoplasma y núcleo de células del mesófilo foliar de N. benthamiana. El clon infectivo del CLRDV constituye una herramienta que permitirá avanzar en el estudio de la expresión y función de los genes virales y de la replicación viral por genética reversa. Se trata del primer clon infectivo capaz de infectar plantas de algodón y permite acelerar los procesos de búsqueda de genes de resistencia en bancos de germoplasma de algodón. Además, facilitará el trabajo en plantas modelo utilizadas para el estudio de la interacción planta‐patógeno tales como N. benthamiana, así como el uso de las colecciones de mutantes de A. thaliana para profundizar en el estudio de las funciones virales y su interacción con el hospedador. Estos resultados representan un importante avance en el conocimiento de la función de las proteínas codificada por el CLRDV, especialmente en la comprensión de la función e interacciones de P0 con proteínas de sus hospedantes. En conclusión, proporcionan un punto de partida para la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la enfermedad azul producida por la infección del CLRDV.

Abstract:

Cotton blue disease is the most important viral disease of cotton in the southern part of South America. Its etiological agent, cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), is specifically transmitted to host plants by the aphid vector (Aphis gossypii) and any attempt to perform mechanical inoculations of this virus into its host has failed. This limitation has held back the study of this virus and the disease it causes. In this study, a full-length cDNA of CLRDV was constructed and expressed in vivo under the control of cauliflower mosaic virus 35S promoter. An agrobacterium-mediated inoculation system for the cloned cDNA construct of CLRDV was developed. Northern and immune blot analyses showed that after several weeks the replicon of CLRDV delivered by Agrobacterium tumefaciens in Gossypium hirsutum plants gave rise to a systemic infection and typical blue disease symptoms correlated to the presence of viral RNA and P3 capsid protein. We also demonstrated that the virus that accumulated in the agroinfected plants was transmissible by the vector A. gossypii. This result confirms the production of biologically active transmissible virions. In addition, the clone was infectious in Nicotiana benthamiana plants which developed interveinal chlorosis three weeks postinoculation and CLRDV was detected both in the inoculated and systemic leaves. Attempts to agroinfect Arabidopsis thaliana plants were successful too. Although no symptoms were observed, the P3 capsid protein as well as the genomic and subgenomic RNAs were detected in systemic leaves of some agroinfiltrated plants. This is the first report on the construction of a biologically-active infectious full-length clone of a cotton RNA virus showing successful agroinfection of host and non-host plants. The system herein developed will be useful to study CLRDV viral functions and plant-virus interactions using a reverse genetic approach. To continue with the characterization of viral proteins, interactions between proteins were studied using the two-hybrid system in yeast. By this method, we detected the interaction between viral capsid protein (P3) with one another, P3 with the minor capsid protein P3P5 readthrough and the movement protein (P4) each other. Plants employ RNA silencing as a natural defense mechanism against viruses. As a counter-defense, viruses encode silencing suppressor proteins (SSPs) that suppress RNA silencing. Most, but not all, the P0 proteins encoded by poleroviruses have been identified as SSP. In this study, we demonstrated that Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV, genus Polerovirus) P0 protein suppressed local silencing that was induced by sense or inverted repeat transgenes in Agrobacterium co-infiltration assay in Nicotiana benthamiana plants. A CLRDV full-length infectious cDNA clone that is able to infect N. benthamiana through Agrobacterium-mediated inoculation also inhibited local silencing in co-infiltration assays, suggesting that the P0 protein exhibits similar RNA silencing suppression activity when expressed from the full-length viral genome. On the other hand, the P0 protein did not efficiently inhibit the spread of systemic silencing signals. Moreover, Northern blotting indicated that the P0 protein inhibits the generation of secondary but not primary small interfering RNAs. The study of CLRDV P0 suppression activity may contribute to understanding the molecular mechanisms involved in the induction of cotton blue disease by CLRDV infection. Using an in silico tool, MP and CP protein were identified as other potential SSPs. Their activity was analyzed as was evaluated for P0 protein, but these proteins did not show suppressive activity silencing in either system used. An outbreak of a new disease occurred in cotton fields in northwest Argentina starting in the 2009/10 growing season and is still spreading steadily Argentina. The new leafroll disease in CBD-resistant cotton plants is caused by an atypical strain of CLRDV called Cotton leafroll dwarf virus-at (CLRDV-at). We evaluated the virulence of P0 protein from CLRDV end P0 from CLRDV-at in the context of a heterologous virus infection. The exacerbation of symptoms of PVX was analyzed in the presence of the protein P0 in N. benthamiana plants. It was noted that the construction PVX-P0^CLRDV developed severe symptoms than wild PVX or PVX-P0^CLRDV-at while PVX-P0^CLRDV-at developed mild symptoms, showing that P0^CLRDV presents greater virulence. Previous studies showed that turnip yellows virus P0 protein interacts with S-phase kinase-associated protein 1 (SKP1), a core subunit of SCF-ubiquitin ligase complex, through the F-Box (LPXXL/IX_10-13P) domain and the inhibitory effect of polerovirus P0s on the production of secondary siRNAs is mediated by destabilization of ARGONAUTE 1 (AGO1) protein. We employed two hybrid yeast system to investigate whether P0^CLRDV interacts with SKP1 from N. benthamiana or the orthologue in cotton GSK1. We showed that P0^CLRDV interacts with both SKP1 and GSK1. In addition, point mutations in the F-Box-like motif of P0^CLRDV, P0mut2 (aaFIIX_10a) and P0^mut3 (aaFIIX_10P) abolish the P0-SKP1 and P0-GSK1 interactions. Besides, the suppressive activity of the mutants was analyzed by methods based on the silencing of the GFP protein assays, in which P0^mut2 and P0^mut3 mutants completely lost their suppressive activity while P0^mut1 (P0CLRDV with the CLRBV F-Box motif: LPFLVX_10P) and P0^mut4 (P0^CLRDV-at with the CLRDV F-Box motif: LPFLIX_10P) mutants retained their suppressive activity with a slight variation in suppression intensities. While P0^mut1 decreased, their activity regarding P0^CLRDV and P0^mut4 increased respect P0^CLRDV-at. Consistent with the in planta results the P0^mut3 and P0^mut2 do not interacts with GSK1 or SKP1, while P0^mut4 and P0^mut1 retained the ability to interact with them. Finally, to test if P0^CLRDV and the mutants can also induce AGO1 decay, a FLAG-tagged AGO1 was agroinfiltrated into N. benthamiana leaves in the presence or absence of P0^CLRDV or the mutants. Expression of P0^CLRDV induced a strong reduction on the levels of AGO1-FLAG protein. These results indicate that the LP consensus of the F-Box domain is essential for P0 to hold suppressive activity and to interact with the plant proteins. The study of P0^CLRDV mechanism contributes to understanding the induction of cotton blue disease. Lastly, the subcellular localization of the P0 protein was analyzed by expressing P0 fused to GFP. Employing confocal microscopy, we determined that P0 is localized in cytoplasm and nucleus of mesophyll leaf cells of N. benthamiana. The infectious clone of CLRDV is a tool that will let to advance in the study of viral genes and viral replication by reverse genetics. This is the first infectious clone capable of infecting cotton plants and speeds up screening processes of resistance genes in cotton germplasm banks. It will facilitate the work on model plants used for the study of plant-pathogen interaction such as N. benthamiana and the use of collections of A. thaliana mutants to extend the study of viral functions and their interaction with the host. These results represent a significant advance in understanding the function of the proteins encoded by the CLRDV, especially in understanding the function and interaction of proteins P0 with their hosts. In conclusion, they provide a starting point for understanding the molecular mechanisms involved in the blue disease caused by CLRDV.

Citación:

---------- APA ----------

Delfosse, Verónica Cecilia. (2017). Caracterización de las proteínas codificadas por el Cotton leafroll dwarf virus y de un clon infectivo del virus. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6229_Delfosse

---------- CHICAGO ----------

Delfosse, Verónica Cecilia. "Caracterización de las proteínas codificadas por el Cotton leafroll dwarf virus y de un clon infectivo del virus". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2017.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6229_Delfosse

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