Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | FluoFagos de segunda generación para detección y determinación de susceptibilidad a antibióticos en Mycobacterium tuberculosis |
| Título alternativo: | Second generation FluoPhage detection and antibiotic susceptibility testing in Mycobacterium tuberculosis |
| Autor: | Rondón Salazar, Liliana |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Bacterias Gram positivas, sus Fagos y Estrés
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| Publicación en la Web: | 2018-03-31 |
| Fecha de defensa: | 2017-03-23 |
| Fecha en portada: | 2017 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Director: | Piuri, Mariana |
| Consejero: | Pettinari, Julia |
| Jurado: | Ritacco, Viviana; Bigi, Fabiana; García, Verónica E. |
| Idioma: | Español |
| Tema: | biología/microbiología
biología/bioquímica
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| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6198_RondonSalazar |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6198_RondonSalazar.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6198_RondonSalazar |
| Ubicación: | Dep.QUI 006198 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Rondón Salazar, Liliana. (2017). FluoFagos de segunda generación para detección y determinación de susceptibilidad a antibióticos en Mycobacterium tuberculosis. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6198_RondonSalazar |
Resumen:
El diagnóstico actual de la tuberculosis (TB) se realiza por técnicas lentas y laboriosas que llevan desde semanas a meses o con métodos moleculares rápidos pero de alto costo. El desarrollo de FluoFagos, se basa en el uso innovador de fagos que acarrean genes fluorescentes que permiten la detección específica y sensible de Mycobacterium spp. viables y la determinación del perfil de susceptibilidad a antibióticos directamente en muestras clínicas de pacientes con sospecha de la enfermedad. La aparición de fluorescencia define la viabilidad de la bacteria, lo que es crucial para determinar el tratamiento a seguir. En este contexto existe una necesidad apremiante de métodos diagnósticos rápidos y económicos que combinen sensibilidad, especificidad, bioseguridad, y la determinación rápida de susceptibilidad a los fármacos y que puedan ser aplicados en centros de atención primaria de países en desarrollo donde la incidencia de la TB es alta. Por lo anteriormente planteado, el objetivo principal de esta tesis es validar nuevas metodologías basadas en el uso de FluoFagos para la detección y testeo de susceptibilidad a antibióticos en Mycobacterium tuberculosis. Se realizó la incorporación de tags en la cápside del fago para su empleo en la captura de complejos fago-bacteria comprobando su incorporación mediante western-blot, ELISA e inmunoelectromicroscopía. Los lisados de fagos que acarrean el ¨tag¨ se emplearon para recuperar complejos fago-bacteria usando Mycobacterium smegmatis y se evaluó la afinidad de captura mediante microscopía de fluorescencia. Además, se estudiaron algunos parámetros que pueden afectar el proceso de infección entre ellos los métodos de decontaminación de las muestras clínicas empleados de forma rutinaria en los centros de salud. Por otra parte, se comparó la performance de FluoFagos optimizados, reporteros del gen que codifica para la proteína mCherrybomb para la detección y determinación de resistencia a rifampicina en muestras clínicas (esputos), relacionando la sensibilidad y especificidad con los obtenidos por el método de las proporciones usado como método de referencia. Las muestras clínicas empleadas en este estudio fueron facilitadas por el Laboratorio de bacteriología de la TBC (Inst. Vaccarezza-Hospital Muñiz). Finalmente, se propuso realizar el estudio de las características clínico-epidemiológicas de los pacientes incluidos en la presente investigación con el fin de conocer los aspectos más relevantes asociados a la tuberculosis en la República Argentina. Los resultados obtenidos resaltan la utilidad de los FluoFagos para ser implementados como un método rápido, económico, sensible y específico para diagnosticar la tuberculosis y la resistencia a rifampicina directamente en muestras de esputo, facilitando el tratamiento y prevención de la diseminación de cepas resistentes.
Abstract:
The current diagnosis of tuberculosis (TB) is performed by slow and laborious techniques that take from weeks to months or rapid and expensive molecular methods. The development of FluoPhages is based on the innovative use of phages that carry fluorescent genes allowing specific and sensitive detection of viable Mycobacterium spp. and determination of antibiotic resistance profile directly in clinical samples of patients suspected of having the disease. The appearance of fluorescence correlates with the viability of the bacteria, which is crucial to decide the course of treatment. In this context, there is an urgent need for quick and inexpensive diagnostic methods that combine sensitivity, specificity, biosafety, and the rapid determination of susceptibility to antibiotics that could be applied in primary care centers of developing countries where the incidence of TB is high. Taking this in consideration, the main aim of this thesis is to validate new methodologies based on the use of FluoPhages for detection and antibiotic susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. A tag was added to the phage capsid to allow the capture of phage-bacteria complexes. Incorporation of the tag was checked by Western blot, ELISA and inmunoelectromicroscopy. Also, some parameters that can affect the process of infection were studied including methods of decontamination of clinical samples routinely employed in health centers. Phage lysates that carry the tag were used to capture phage-bacteria complexes using Mycobacterium smegmatis and the affinity of the capture was evaluated by fluorescence microscopy. Furthermore, we compared the performance of an optimized FluoPhage, carrying mCherrybomb reporter gene, for detection and identification of rifampicin resistance bacteria in clinical samples (sputum). The sensitivity and specificity was compared with the proportion method used as gold standard. The samples used in this study were provided by the Laboratory of bacteriology of tuberculosis (Vaccarezza Institute - Muñiz Hospital). Finally we did an epidemiological study of patients included in this study in order to know the most important aspects associated with tuberculosis disease in Argentina. The results highlight the utility of Fluophages to be implemented as a fast, inexpensive, sensitive and specific method for tuberculosis diagnosis and detection of rifampicin resistance directly in sputum samples, facilitating the treatment and prevention of the spread of resistant strains.
Citación:
---------- APA ----------
Rondón Salazar, Liliana. (2017). FluoFagos de segunda generación para detección y determinación de susceptibilidad a antibióticos en Mycobacterium tuberculosis. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6198_RondonSalazar
---------- CHICAGO ----------
Rondón Salazar, Liliana. "FluoFagos de segunda generación para detección y determinación de susceptibilidad a antibióticos en Mycobacterium tuberculosis". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2017.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6198_RondonSalazar
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