Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Estudio de la regulación de la respuesta T CD8+ frente a Mycobacterium tuberculosis en individuos coinfectados con tuberculosis y HIV-1 |
| Título alternativo: | Study of the regulation of CD8+ T cell responses against Mycobacterium tuberculosis and HIV.1 dually infected individuals |
| Autor: | Suárez, Guadalupe Verónica |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida (INBIRS). CONICET
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| Publicación en la Web: | 2018-06-29 |
| Fecha de defensa: | 2017-03-01 |
| Fecha en portada: | 2016 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Director: | Quiroga, María Florencia |
| Consejero: | Rabinovich, Gabriel |
| Jurado: | Sasiain, María del Carmen; Giabartolomei, Guillermo H.; Baldi, Pablo C. |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6173_Suarez |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6173_Suarez.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6173_Suarez |
| Ubicación: | Dep.QUI 006173 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Suárez, Guadalupe Verónica. (2016). Estudio de la regulación de la respuesta T CD8+ frente a Mycobacterium tuberculosis en individuos coinfectados con tuberculosis y HIV-1. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6173_Suarez |
Resumen:
La tuberculosis (TB) es la primera causa de muerte en pacientes HIV+. La infección por Mycobacterium tuberculosis induce la activación de células T CD8+, sin embargo, aún se desconoce si estas células pueden mediar protección contra esta enfermedad. Durante la infección por HIV, que incrementa dramáticamente el riesgo a desarrollar TB, los linfocitos T CD4+ específicos para M. tuberculosis disminuyen drásticamente. Por lo tanto, la caracterización de las respuestas T CD8+ en pacientes coinfectados con TB y HIV podría revelar potenciales blancos terapéuticos para el desarrollo de terapias adyuvantes. En el presente trabajo de tesis caracterizamos las respuestas T CD8+ específicas contra M. tuberculosis en pacientes coinfectados con TB y HIV-1 (HIV-TB) a través del estudio de la distribución de las poblaciones de memoria y efectoras en células T CD8+ por citometría de flujo y de la caracterizaron de las respuestas antígeno-específicas mediante la estimulación ex vivo con antígenos de M. tuberculosis en estos pacientes. A su vez, evaluamos el rol de la activación de los macrófagos y de la vía de PD-1 sobre la función citotóxica de las células T CD8+, para lo cual desarrollamos un sistema in vitro que nos permitió evaluar las respuestas T CD8+ citotóxicas específicas contra M. tuberculosis utilizando macrófagos diferenciados de monocitos como células blanco. Llamativamente, los pacientes HIV-TB mostraron una inhibición de las respuestas T CD8+ específicas para M. tuberculosis asociada a una diferenciación deficiente en comparación con dadores sanos y pacientes HIV+. Específicamente, las células diferenciadas terminalmente mostraron un fenotipo poco diferenciado, con menor expresión de la molécula CD45RA. A su vez, el porcentaje de estas células correlacionó positivamente con la expresión de PD-1 en células CD27+, sugiriendo que el agotamiento y la diferenciación deficiente en células T CD8+ están asociados en el marco de la coinfección HIV-TB. Estudios previos de nuestro grupo mostraron que los pacientes HIV-TB presentan un desbalance en los niveles de hormonas adrenales inmunomoduladoras, como el cortisol y la dehidroepiandrosterona (DHEA). A su vez, trabajos previos demostraron que la administración de DHEA incrementa respuestas específicas contra M. tuberculosis y otros patógenos en modelos murinos y durante la TB activa en humanos. Nosotros observamos que el nivel plasmático de DHEA correlacionó positivamente con el porcentaje de células T CD8+ diferenciadas terminalmente, lo que sugiere que el desbalance endócrino asociado a la coinfección por HIV y TB contribuye a la disfunción de estas células. Posteriormente, evaluamos el efecto modulador de DHEA sobre la función y el estado de diferenciación de células T CD8+. Así, DHEA incrementó las respuestas T CD8+ específicas para M. tuberculosis como también su diferenciación terminal in vitro. Con el objeto de estudiar el rol de la activación de los macrófagos y de la vía de PD-1 sobre la función citootóxica de células T CD8+, establecimos un sistema in vitro para evaluar las respuestas T CD8+ citotóxicas específicas contra M. tuberculosis utilizando macrófagos diferenciados de monocitos como células blanco. Mediante este ensayo pudimos detectar la citotoxicidad específica contra diversos estímulos incluidos antígenos de M. tuberculosis. A su vez, este método nos permitió determinar que la degranulación citotóxica es el principal mecanismo involucrado en la citotoxicidad producida durante el co-cultivo de células T CD8+ aisladas con macrófagos diferenciados in vitro. Los resultados mostraron que la activación por IFN-γ, que induce una polarización de los macrófagos hacia un perfil M1, incrementó notablemente la citotoxicidad antígeno-específica inducida por células T CD8+ sobre macrófagos diferenciados in vitro en comparación con los macrófagos no activados o activados alternativamente. A su vez, la expresión de PD-L1 en los macrófagos se incrementó prominentemente luego de su activación con IFN-γ. En concordancia con esto, tanto la expresión de PD-L1 en monocitos/macrófagos como la expresión de PD-1 en células T CD8+ provenientes de derrames pleurales de pacientes con pleuritis tuberculosa se vio incrementada notablemente respecto de su expresión en células de sangre periférica, indicando que la vía de PD-1 se encuentra inducida en el sitio de infección durante la pleuritis tuberculosa. Finalmente, observamos que la inhibición de la vía de PD-1/PD-L1 mediante el bloqueo de PD-L1 incrementó la citotoxicidad específica inducida por células T CD8+ tanto en macrófagos no activados como en macrófagos activados por IFN-γ. Por el contrario, el bloqueo de PDL-1 no tuvo efecto sobre la citotoxicidad ejercida sobre macrófagos polarizados hacia un perfil M2. En su conjunto, los resultados del presente trabajo de tesis muestran que la función citotóxica específica contra M. tuberculosis es deficiente en las células T CD8+ de pacientes coinfectados con HIV y Tuberculosis. A su vez, observamos que el desbalance hormonal característico de estos pacientes contribuye a la disfunción que presentan estas células y pudimos probar la capacidad de la hormona adrenal DHEA para restaurar, al menos parcialmente, esta función. Finalmente, determinamos la importancia de la activación de los macrófagos hacia un perfil M1 sobre la capacidad citotóxica de las células T CD8+, así como el rol inhibitorio de esta función por parte de la vía PD-1/PD-L1, mediante el desarrollo de un método fehaciente para evaluar la citotoxicidad in vitro. Así, nuestros hallazgos contribuyen al conocimiento de la inmunopatología Tuberculosa en pacientes infectados con HIV, ayudando a dilucidar los procesos que subyacen a la mayor susceptibilidad a la Tuberculosis en estos pacientes. Asimismo, nuestros resultados ratifican la importancia de la inmunidad mediada por células T CD8+ durante la infección tuberculosa, contribuyendo al conocimiento de estas células como posibles blancos terapéuticos en el desarrollo de mejores tratamientos para la TB en pacientes HIV+ así como de una tan necesaria vacuna efectiva contra la Tuberculosis.
Abstract:
Tuberculosis (TB) is the first cause of death among HIV-infected people. Mycobacteriumtuberculosis infection elicits CD8+ T-cell responses, which are recruited to the lung duringinfection and found in the granulomas of infected people, although, it is still unknown whether CD8+ T cells mediate protection against TB. During HIV infection, which dramatically increases TB risk, anti-tubercular CD4+ T cell responses are severely diminished. Therefore, wehypothesized that characterizing CD8+ T cell responses in HIV-infected patients would uncoverpotential therapeutic targets for adjuvant anti-TB treatment in these patients. In the presentwork, we characterized TB-specific CD8+ T cell responses in a cohort of HIV-1-TB co-infectedpatients and compared these responses with those found in healthy subjects and HIV-infectedpatients. We studied effector/memory distribution of CD8+ T cells by multicolor flow cytometryand characterized specific anti-TB CD8+ T cell responses by ex-vivo stimulation with M.tuberculosis bacilli. One of our most important findings was that HIV-TB patients showed a strong inhibition inspecific CD8+ T cell responses due to impaired cytotoxic cells differentiation. Specifically,terminally differentiated CD8+ T cells showed a less differentiated phenotype with lower levelsof CD45RA. Also, the percentage of these less differentiated cells positively correlated withthose of PD-1+ cells among central memory CD8+ T cells, suggesting that exhaustion anddeficient differentiation are related during HIV-TB co-infection. Previous work from our group showed that HIV-TB patients exhibit an imbalance in immunemodulatoryadrenal hormones, like cortisol and dehydroepiandrosterone (DHEA). Also, inprevious works DHEA improved specific immune responses against M. tuberculosis and otherpathogens in mouse models and also during active TB in humans. We observed that DHEAplasma levels positively correlated with those of CD8+ T cells fully differentiated, suggesting Abstractthat the endocrine imbalance associated to HIV-TB co-infection contributes to dysfunction inthese cells. Then we evaluated the effect of DHEA in-vitro. We found that DHEA improved TB-specificcytotoxic CD8+ T cell responses and CD8+ T cell differentiation in cells from HIV-TB patients. In order to evaluate the role or the macrophage activation and PD-1 pathway on CD8+ T cellsfunction, we established an in vitro system to study cytotoxic CD8+ T cell responses against M.tuberculosis antigens by using monocyte-derived macrophages as target cells. By this, we wereable to detect cytotoxic specific responses against a variety of stimuli including M. tuberculosisantigens. This method also allowed us to determine the preponderant role of cytotoxicdegranulation as the main mechanism involved in cytotoxic killing during CD8+ T cellmacrophageco-culture in vitro. Our results showed that IFN-γ activation, which induced M1 polarization, significantly increasedantigen-specific CD8+ T cell cytotoxicity over in vitro differentiated macrophages, compared tonon-activated or M2 activated macrophages. Additionally, PD-L1 expression in macrophageswas notably increased after IFN-γ activation. Accordingly, both the expression of PD-L1 inmonocytes/macrophages and the expression of PD-1 in CD8+ T cells from pleural effusion wereincreased compared to peripheral blood in TB pleurisy patients, showing that PD-1 pathway isexacerbated in the site of infection during TB pleurisy. Finally, PD-1/PD-L1 pathway inhibitionincreased specific cytotoxicity by CD8+ T cells on macrophages in vitro both in non-activatedand IFN-γ-activated macrophages. On the contrary, PDL-1 blockade had no effect over thecitotoxicity exerted by CD8+ T cells on M2-polarized macrophages. The results shown in the present study show that cytotoxic function against M. tuberculosisantigens is impaired in CD8+ T cells from HIV-TB coinfected patients. Also, we showed that thecharacteristic hormonal imbalance in these patients contributes to CD8+ T cell dysfunction while DHEA can restore it, at least partially. Finally, we determined the importance of macrophageactivation to an M1 profile over CD8+ T cell cytotoxicity, as well as the inhibitory role of PD- Abstract 1/PDL-1 pathway over this function, by developing a feasible method to study cytotoxic killing invitro. Altogether, our findings contributes to the knowledge of tuberculous immune pathology in HIV+persons, helping to disclose the process beneath the higher susceptibility for TB in HIV-infectedpatients. Furthermore, our results support the importance of CD8+ T cell mediated immunityduring M. tuberculosis infection, providing information on these cells as new cell targets for thedevelopment of better therapeutic treatments for TB inr HIV+ patients, as well as anindispensable effective vaccine against Tuberculosis.
Citación:
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Suárez, Guadalupe Verónica. (2016). Estudio de la regulación de la respuesta T CD8+ frente a Mycobacterium tuberculosis en individuos coinfectados con tuberculosis y HIV-1. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6173_Suarez
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Suárez, Guadalupe Verónica. "Estudio de la regulación de la respuesta T CD8+ frente a Mycobacterium tuberculosis en individuos coinfectados con tuberculosis y HIV-1". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2016.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6173_Suarez
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