Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Caracterización de distintas fuentes de cAMP en la señalización del GPCR CRHR1 |
| Título alternativo: | Characterization of different cyclic AMP sources involved in the signaling mechanisms of the GPCR CRHR1 |
| Autor: | Inda, María Carolina |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires (IBioBA)
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| Publicación en la Web: | 2017-07-25 |
| Fecha de defensa: | 2017-03-15 |
| Fecha en portada: | 2017 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |
| Director: | Silberstein Cuña, Susana |
| Consejero: | Arzt, Eduardo |
| Jurado: | Rossi, Mario; Colman-Lerner, Alejandro; Davio, Carlos |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | CRH; GPCR; AMP CICLICO; ADENILIL CICLASA SOLUBLE; SEÑALIZACION DESDE ENDOSOMASCRH; GPCR; CYCLIC AMP; SOLUBLE ADENYLYL CYCLASE; ENDOSOME-BASED SIGNALING |
| Tema: | biología/biología molecular y celular
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| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6170_Inda |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6170_Inda.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6170_Inda |
| Ubicación: | Dep.BIO 006170 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Inda, María Carolina. (2017). Caracterización de distintas fuentes de cAMP en la señalización del GPCR CRHR1. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6170_Inda |
Resumen:
Los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son los mediadores de las respuestas celulares auna gran cantidad de estímulos, así como también el blanco de muchas drogas terapéuticas. Elrol clásico de los GPCRs es acoplar la unión de ligandos a la activación de proteínas Gheterotriméricas, que a su vez regulan a múltiples proteínas efectoras. Recientemente se hademostrado que los modos de señalización de los GPCR son mucho más complejos,involucrando también mecanismos independientes de proteínas G y señalización dependiente dela internalización del receptor. La hormona liberadora de corticotropina (CRH) ejerce un rol clave en la respuesta integrada alestrés. Además de regular la activación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), CRH estáampliamente distribuida en el sistema nervioso central, donde funciona como unneuromodulador, integrando aspectos comportamentales y afectivos de la respuesta a estrés. Seha demostrado que la desregulación de la acción de CRH a través de su receptor de alta afinidad, CRHR1, se encuentra involucrada en el desarrollo de estadios patológicos asociados al estréscomo ansiedad y depresión. CRHR1 es un GPCR de clase B, que al activarse principalmente se acopla a proteína Gs y llevaa un aumento del segundo mensajero AMP cíclico (cAMP) y la activación de múltiples vías deseñalización. Es de particular interés la fosforilación de la MAPK ERK1/2, que induce latranscripción de Pomc para activar el eje HPA en corticotrofos, y se dispara en estructuras delcerebro asociadas a aspectos comportamentales de la respuesta a estrés frente a la estimulacióncon CRH. Habíamos descripto previamente que CRHR1 activa mecanismos de señalización dependientesde proteína G y otros dependientes de la endocitosis del receptor. Estos dos componentes derespuesta pueden evidenciarse como dos fases diferentes de activación de ERK1/2 en la líneacelular hipocampal murina HT22 transfectada establemente con CRHR1 (HT22-CRHR1). Eneste trabajo, nos focalizamos en la respuesta de cAMP mediada por CRHR1, utilizando métodosclásicos de biología molecular en combinación con biosensores basados en la transferencia deenergía resonante de Förster (FRET) para estudiar por visualización dinámica de célula únicalos mecanismos de señalización de CRH. En primer lugar demostramos que al estimular CRHR1, el aumento en los niveles de cAMP nosólo está mediado por las adenilil ciclasas transmembrana (tmACs) sino también por una adenilil ciclasa soluble (sAC) en las células HT22-CRHR1. sAC es una fuente atípica de cAMPya que es insensible a proteína G y es regulada por calcio y bicarbonato. Además, se hareportado que sAC está presente en distintas localizaciones subcelulares, formandomicrodominios de señalización. La respuesta de cAMP a CRH también se encontró mediadatanto por tmAC como por sAC en la línea celular derivada de corticotrofos AtT20, pero no asíen las células 3T3L1-CRHR1. Sin embargo, observamos que tanto en células HT22-CRHR1como en AtT20, sAC no participa en la señalización de otros ligandos de GPCRs, comoisoproterenol o PACAP38, respectivamente. Estos resultados indican que el rol de sAC en latransducción de señales de un GPCR depende del contexto celular y del receptor involucrado. La estimulación con CRH genera un aumento en los niveles de calcio intracelular, y al bloquearla respuesta de calcio se observó un patrón de cAMP y ERK1/2 en respuesta a CRH similar alque se obtiene al bloquear sAC. Esto sugiere que calcio es el activador de sAC río abajo de CRHR1. Luego, nos propusimos caracterizar si ambas fuentes de cAMP contribuyen a un pool común decAMP o si pueden identificarse roles particulares para cada adenilil ciclasa en la respuesta. Observamos que tanto tmACs como sAC participan en la fase aguda de activación de ERK1/2,pero que en la fase sostenida de fosfo-ERK1/2, dependiente de la internalización de CRHR1,sólo sAC está involucrada. Más aún, demostramos que el CRHR1 continúa generando cAMPdesde estaciones endocíticas, y que es sAC la responsable de esta producción una vezinternalizado CRHR1. En conclusión, a través de la caracterización de los mecanismos moleculares activados por CRHR1, se hallaron nuevas evidencias que refuerzan el modelo emergente de señalización por GPCR en el que la respuesta de cAMP no ocurre exclusivamente a nivel de la membranaplasmática y donde sAC representa una fuente alternativa de cAMP regulada por GPCRs.
Abstract:
G protein–coupled receptors (GPCRs) are the mediators of cellular responses to a wide varietyof stimuli, as well as the target of many therapeutic drugs. The classical role of GPCRs is tocouple the binding of ligands to the activation of specific heterotrimeric G proteins, leading tothe regulation of downstream effector proteins. Recently, it has been demonstrated that GPCRsignaling is much more complex, including G protein–independent mechanisms and receptorinternalization dependent signaling. Corticotropin-releasing hormone (CRH) plays a critical role in the integrated stress response. Besides being the driver of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis, CRH is widelydistributed in the central nervous system, where it functions as a neuromodulator, integratingaffective and behavioral aspects of the stress response. It has been demonstrated that thedysregulation of CRH action through its high-affinity type 1 receptor (CRHR1) is crucial in thepathogenesis of stress-related affective disorders. CRHR1 is a class B GPCR that, upon ligand activation, signals mainly by Gs coupling, leadingto the increase of the second messenger cyclic AMP (cAMP) and the activation of multiplesignaling cascades. Of particular interest is the phosphorylation of the MAPK ERK1/2, which isinvolved in the induction of Pomc transcription to activate the HPA axis in pituitarycorticotrophs, and that is activated in specific brain structures related to behavioral aspects ofthe stress response upon CRH stimulation. We have previously described that CRHR1 activates G protein-dependent and receptorendocytosis-dependent mechanisms. These two components of the response can be evidenced astwo distinct phases of ERK1/2 activation in the mouse hippocampal cell HT22 stablytransfected with CRHR1 (HT22-CRHR1). In this work, we focused on the cAMP response of CRHR1, using classical cell biology tools in combination with Förster resonance energy transfer (FRET)–based biosensors, to study CRH signaling mechanisms at the single cell level by liveimaging. First, we demonstrated that upon CRHR1 stimulation, cAMP level increase is not only mediatedby transmembrane adenylyl cyclases (tmACs), but also by a soluble adenylyl cyclase (sAC) in HT22-CRHR1 cells. sAC is an atypical cAMP source, insensitive to G protein but regulated bybicarbonate and calcium. In addition, it has been reported that sAC is localized in differentintracellular locations, generating particular signaling microdomains. cAMP response to CRH was also found mediated by both tmACs and sAC in the corticotroph-derived cell line AtT20,but sAC was not involved in the response in 3T3L1-CRHR1 cells. However, we determined thatin HT22-CRHR1 cells as well as AtT20 cells, sAC does not participate in the signaling pathwayof other GPCR ligands such as isoproterenol or PACAP38, respectively. These results indicatethat the role of sAC in the signal transduction of a GPCR depends on the cellular context and thereceptor involved. CRH stimulation leads to a rise in intracellular calcium levels, and when thecalcium response is blocked the cAMP and ERK1/2 pattern in response to CRH is similar to theone observed when sAC is blocked. This suggests that calcium is the activator of sACdownstream CRHR1. Then, we aimed to characterize if both cAMP sources contribute to a common cAMP pool or ifparticular roles for each type of adenylyl cyclase may be identified in the response. We observedthat both tmACs and sAC participate in the acute activation of ERK1/2, but in the sustainedphospho-ERK1/2 phase only sAC is involved. Moreover, we demonstrated that CRHR1continues to generate cAMP from endocytic stations, and that sAC is the enzyme responsible forthis production once CRHR1 is internalized. In conclusion, by characterizing the molecular mechanisms activated by CRHR1, we found newevidences that strengthen the emerging model of GPCR signaling in which the cAMP responsedoes not occur exclusively at the plasma membrane and introducing the notion of sAC as analternative source of cAMP.
Citación:
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Inda, María Carolina. (2017). Caracterización de distintas fuentes de cAMP en la señalización del GPCR CRHR1. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6170_Inda
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Inda, María Carolina. "Caracterización de distintas fuentes de cAMP en la señalización del GPCR CRHR1". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2017.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6170_Inda
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