Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Prevención y tratamiento de Rotavirus A mediante nanoanticuerpos VHH anti-VP6 |
| Título alternativo: | Prevention and treatment of Rotavirus A using anti- VP6 VHH |
| Autor: | Maffey, Lucía |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | INTA Castelar. Instituto de Virología, CICVyA
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| Publicación en la Web: | 2017-06-09 |
| Fecha de defensa: | 2016-12-16 |
| Fecha en portada: | 2016 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Director: | Parreño, Viviana |
| Director Asistente: | Vega, Celina G. |
| Consejero: | Alché, Laura |
| Jurado: | Castello, Alejandro A.; Candurra, Nélida A.; Flichman, Diego M. |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | ROTAVIRUS A; DIARREA; VHH; NANOANTICUERPOS RECOMBINANTES; PREVENCION; TRATAMIENTO TERAPEUTICO; RATONES BALB/C; OPTIMIZATION; MUTANTES VIRALES DE ESCAPE; INMUNOGENICIDADROTAVIRUS A; DIARRHEA; RECOMBINANT NANOBODIES; PREVENTION; THERAPEUTIC TREATMEN; BALB/C MICE; OPTIMIZATION; VIRAL ESCAPE MUTANTS; IMMUNOGENICITY |
| Tema: | biología/virología
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| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6110_Maffey |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6110_Maffey.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6110_Maffey |
| Ubicación: | Dep.QUI 006110 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Maffey, Lucía. (2016). Prevención y tratamiento de Rotavirus A mediante nanoanticuerpos VHH anti-VP6. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6110_Maffey |
Resumen:
La diarrea asociada a Rotavirus A (RVA) representa una de las principales causas demortalidad infantil a nivel mundial. Si bien la vacunación masiva contra RVA ha logrado disminuirsignificativamente las muertes causadas por este patógeno, la disponibilidad y la eficacia de lasvacunas en zonas de bajos recursos es limitada. Por otra parte, el manejo clínico de la infecciónpor RVA se basa en la administración de Sales de Rehidratación Oral (SRO), mientras que lasopciones terapéuticas específicas resultan limitadas. El principal objetivo de este trabajo fueestudiar y optimizar la utilización de dos fragmentos correspondientes a la porción variable deanticuerpos de cadena pesada derivados de llama (VHH) dirigidos contra la proteína VP6 – 2KD1 y 3B2– para la prevención y el tratamiento de la diarrea asociada a RVA y comparar su eficaciarespecto de otras opciones terapéuticas disponibles. En primer lugar, se analizó la eficacia de ambos clones de VHH anti-VP6 para laprevención y el tratamiento de la diarrea inducida por RVA en un modelo de ratón (BALB/c)lactante inoculado con una cepa virulenta de RVA murino (EcW, G16P[16]I7). En el tratamientoprofiláctico, los VHH fueron administrados oralmente dos horas antes de la inoculación viralmientras que en el tratamiento terapéutico, los VHH fueron administrados oralmente luego de lainoculación viral, tanto en forma previa a la aparición de los síntomas (pre-sintomático) como luegode la ocurrencia de diarrea (post-sintomático). En todos los casos, ratones lactantes de cuatro díasde vida fueron inoculados con 1778 DD50 (Dosis Diarrea 50) de RVA murino a los 0 Días Post Inoculación (DPI) y examinados diariamente para determinar la ocurrencia de diarrea y recolectarmuestras de heces. Los ratones tratados y el control no tratado fueron sacrificados en formasecuencial entre los 0 y los 6 DPI para el tratamiento profiláctico y los 0 a 7 DPI en el caso de lostratamientos terapéuticos pre y post-sintomáticos. Luego de la eutanasia, se colectaron muestrasde intestinos y de suero. 1. Ensayos profilácticos. Se evaluó la eficacia de dos dosis de VHH,utilizando cuatro camadas de ratones lactantes para cada tratamiento diario: 160 μg de 2KD1+3B2 (N = 31) y 200 μg de 2KD1+3B2 (N = 30). En ambos casos, el tratamiento comenzó a los -1 DPI ycontinuó hasta los 6 DPI. En el DPI 0, los VHH fueron administrados dos horas antes de lainoculación viral. Los controles incluidos fueron ratones inoculados no tratados (control no tratado)y ratones no inoculados (control normal). 2. Ensayo terapéutico pre-sintomático. Se evaluaroncuatro tratamientos orales: 160 μg de 2KD1+3B2 (80 μg de cada uno) (N = 25), 200 μg de 2KD1+3B2 (100 μg de cada uno) (N = 28), 200 μg de 3B2 (N = 24), 200 μg de 2KD1 (N = 30). Paraambos ensayos, se determinó también la presencia de anticuerpos anti-RVA en muestras desueros e intestino a los 0, 7 y 40 DPI. Asimismo, se evaluó el surgimiento de una respuesta inmunehumoral contra el tratamiento de VHH por medición de anticuerpos anti-VHH intestinales y séricosa esos tiempos y el posible surgimiento de mutantes virales de escape al tratamiento mediante PCR, secuenciación completa y análisis filogenéticos del gen codificante de VP6 en muestras deintestinos y heces positivas para RVA luego de 4-6 días de tratamiento. Los resultados obtenidos mostraron que ambas dosis profilácticas de 2KD1+3B2 redujeronsignificativamente la duración y la severidad de la diarrea al igual que el título infeccioso enintestino y la excreción viral en heces. En relación al tratamiento terapéutico pre-sintomático, laadministración conjunta de 2KD1 y 3B2 (200 μg) redujo significativamente la duración y severidadde la diarrea, la infección intestinal y la excreción fecal en relación al grupo no tratado. Mientrasque la misma dosis de 2KD1 o 3B2 (200 μg) también redujo la duración de la diarrea por RVA conrespecto al control, 2KD1 resultó más efectivo en la disminución de la infección intestinal y laexcreción de RVA en heces. Si bien ambos clones presentaron amplia actividad neutralizantecontra diferentes cepas de RVA in vitro, el clon 2KD1 requirió menores concentraciones que 3B2para neutralizar algunas variedades, en particular la cepa de RVA murino usada en los ensayosprevios. Asimismo, 2KD1 presentó valores de afinidad por las partículas de RVA tres veces mayorque 3B2 (EC50). Ni el tratamiento profiláctico ni el tratamiento terapéutico pre-sintomático con VHHanti-VP6 interfirieron con la respuesta inmune humoral del hospedador frente a RVA. Tampoco sedetectaron mutantes virales de escape al tratamiento a nivel de la proteína VP6 en ningún caso. Tratamiento terapéutico post-sintomático. En este caso, los ratones fueron inoculados con 1778 DD50 de RVA murino al cuarto día de vida como ya fuera descripto y recibieron un tratamientodiario de 200 μg de 2KD1 a partir de los 2 DPI, cuando todos los ratones presentaban diarrea,hasta los 7 DPI. El tratamiento terapéutico post-sintomático con 200 μg de 2KD1 redujo la infecciónintestinal por RVA y la excreción viral en heces en relación al control no tratado. Aunque hubo unatendencia a reducir la duración de los síntomas, las diferencias no fueron significativas. Con el objetivo de evaluar la prevención de la diarrea por RVA en un modelo deadministración continua de los VHH, se realizó un nuevo ensayo involucrando ratonas transgénicasque expresaban los VHH anti-VP6 (2KD1+3B2) en leche materna, regulados bajo el promotor del Virus de Tumor Mamario Murino. En este caso, los ratones fueron inoculados a los cuatro días devida con una dosis menor de RVA murino (800 DD50) y se utilizaron cuatro camadas de ratonestransgénicos amamantados por madres transgénicas y cuatro camadas de ratones wild typeamamantados por madres wild type como control. Para descartar que la transgénesis de losejemplares pudiera tener un efecto sobre el desarrollo de la enfermedad por RVA, se efectuó unensayo de cross-fostering en el cual las progenies de cuatro madres transgénicas fueronamamantadas por madres wild type y viceversa. Los ratones transgénicos alimentados por madrestransgénicas presentaron una menor prevalencia de diarrea a los 3, 4 y 7 DPI en relación alcontrol. A los 8 DPI, estos ratones habían resuelto por completo el cuadro clínico. Asimismo,redujeron la infección intestinal por RVA y la excreción viral en heces en comparación con elcontrol. Con respecto a los ensayos de cross-fostering, los resultados obtenidos fueroncontradictorios. Si bien los ratones wild type amamantados por madres transgénicas redujeron laprevalencia y duración de la diarrea en relación a los ratones amamantados por madres wild typecomo se esperaba, presentaron mayores títulos infecciosos en el intestino y una mayor excreciónviral fecal. Con el propósito de comparar la eficacia de la administración oral de VHH anti-VP6 conotras opciones terapéuticas disponibles para tratar la diarrea por RVA, se realizó un últimoexperimento en el modelo de ratón lactante infectado con 1778 DD50 de RVA murino paracomparar la eficacia de los nanoanticuerpos con dos drogas sintéticas (nitazoxanida, crema debismuto) y dos hierbas aromáticas usadas tradicionalmente para el tratamiento de la diarrea (Aloysa citrodora, Piper aduncum): 2KD1+3B2 (50 mg/kg) + SRO, 2KD1(50 mg/kg) + SRO,nitazoxanida (15 mg/kg), crema de Bismuto (750 mg/kg), A. citrodora (infusión, 2 g/kg); P. aduncum (infusión, 2 g/kg). En este caso, los VHH fueron disueltos en SRO dado que la adición de esteexcipiente aumentaba significativamente la resistencia proteolítica frente a enzimas gástricas. Aexcepción de los ratones tratados con nitazoxanida, los restantes tratamientos redujeronsignificativamente la duración y la severidad de la diarrea por RVA en relación al control no tratado. En relación a los títulos infecciosos a nivel intestinal, los ratones tratados con VHH anti-VP6, cremade Bismuto y nitazoxanida disminuyeron la severidad de la infección mientras que aquellostratados con A. citrodora y P. aduncum no mostraron mejoras. La excreción viral en heces sólo seredujo en los ratones tratados con VHH y nitazoxanida pero no se apreciaron diferenciassignificativas en el resto de los tratamientos. El presente trabajo de tesis muestra que la administración oral de VHH anti-VP6 constituye,no sólo un tratamiento profiláctico efectivo frente a la diarrea asociada a RVA, sino también unaherramienta terapéutica eficaz y segura contra la infección por este virus, incluso luego de laaparición de los primeros síntomas. En este sentido, la terapia oral con VHH anti-VP6 representaríaun mejoramiento considerable en relación a otras opciones terapéuticas disponibles actualmente. Asimismo, los VHH anti-VP6 podrían ser empleados como una estrategia complementaria a lavacunación, especialmente en poblaciones que han mostrado menor eficacia de inmunización. Entérminos generales, el uso de anticuerpos VHH dirigidos contra VP6 presenta un enorme potencialpara su implementación en pacientes inmunocomprometidos y en países de bajos recursos, dondela mortalidad por RVA continúa siendo elevada y las actuales vacunas muestran menor eficacia.
Abstract:
Species A Rotaviruses (RVA) remain a worldwide leading cause of child mortality. Althoughextensive vaccination has achieved a significant reduction in RVA-associated deaths, vaccineefficacy in some impoverished areas remains low. On the other hand, mainstay clinicalmanagement of RVA-associated diarrhea consists of Oral Rehydration Solution (ORS)administration whereas specific therapeutic options are limited. The main goal of this study was toassess and optimize the use of two VP6-specific llama-derived heavy chain antibody fragments (VHH) -2KD1 and 3B2- in the prevention and treatment of RVA-associated diarrhea and to comparethe obtained results with other available therapeutic options against the disease. We first assessed the efficacy of two VP6-specific llama-derived heavy chain antibodyfragments (VHH) -2KD1 and 3B2- as an oral prophylactic and therapeutic treatment against RVAinduceddiarrhea in a neonatal BALB/c mouse model inoculated with virulent murine RVA (ECwstrain, G16P[16]I7). Prophylactic treatment was administered two hours prior to inoculation whereastherapeutic treatment was delivered after viral inoculation, both prior to the symptoms (presymptomatic)and once diarrhea had already occurred (post-symptomatic). In all cases, four-day oldpups were inoculated with 1778 DD50 murine RVA at PID 0 (Post Inoculation Day 0) and examineddaily to assess occurrence of diarrhea and collect feces. Control and treated mice were euthanizedsequentially from PID 0 to 6 for prophylactic groups and from PID 0 to 7 for pre-symptomatic andpost-symptomatic therapeutic groups. After sacrifice, sera and intestinal samples were collected. Prophylactic assays: the efficacy of two doses of VHH was assessed, using four litters of sucklingmice for each daily treatment: 160 μg of 2KD1+3B2 (N = 31) and 200 μg of 2KD1+3B2 (N = 30). Inboth cases the treatment started on PID -1 and was administered until PID 6. On PID 0, the VHHwere administered 2 hours prior to viral challenge. Controls included: untreated ECw RVAinoculatedmice (untreated control group); untreated and not RVA-inoculated mice (normal controlgroup). Pre-symptomatic therapeutic assays: In order to study the therapeutic effect of 2KD1 and 3B2 against RVA-induced diarrhea, treatment administration started at PID 1 and four VHH dailytreatments were tested from PID 1 to 7: 160 μg of 2KD1+3B2 (80 μg of each) (N = 25), 200 μg of 2KD1+3B2 (100 μg of each) (N = 28), 200 μg of 3B2 (N = 24), 200 μg of 2KD1 (N = 30). Includedcontrols were the same as before. For both assays, anti-RVA murine antibodies (Abs) weredetermined in sera and intestinal samples at PID 0, 7 and 40. Occurrence of an immune responseagainst the VHH was examined by measuring anti-VHH Abs titers at PID 0, 7 and 40 in sera andintestinal samples of treated mice and possible uprising of viral escape mutants to the treatmentwas assessed by PCR, complete sequencing and phylogenetic analyses of VP6. Prophylactic administration of both doses of 2KD1+3B2 successfully reduced diarrheaduration and severity as well as intestinal RVA titers and fecal shedding of viral particles. Joint presymptomatictherapeutic administration of 2KD1+3B2 (200 μg/dose) successfully reduced diarrheaduration, RVA infection severity and virus shedding in feces. While the same dose of 2KD1 or 3B2 (200 μg) significantly reduced duration of RVA-induced diarrhea, 2KD1 was more effective indiminishing the severity of intestinal infection and RVA shedding in feces. Although both clonesshowed extensive neutralizing properties against a wide range of RVA strains, 2KD1 required lowerconcentrations than 3B2 to neutralize some of them, particularly the murine RVA strain used in miceassays. Also, 2KD1 evidenced a three-fold higher affinity for RVA particles (EC50) than 3B2. Neitherprophylactic nor pre-symptomatic therapeutic administration of the VHH interfered with the host’shumoral immune response against RVA. No viral escape mutants to the VHH treatment weredetected. Post-symptomatic therapeutic assays: Mouse pups were also inoculated at PID 0 with 1778 DD50 of murine ECw RVA as described and received a daily dose of 200 μg of 2KD1 from PID 2, at which time all mice in the group had already developed diarrhea, to PID 7. When 2KD1 (200μg) was administered after diarrhea development, it also significantly reduced RVA intestinalinfection and fecal shedding. Although treated mice showed a trend towards reducing diarrheaduration, differences with the control group were not significant. In order to assess the prevention of RVA-induced diarrhea in a model of continuousadministration of the VHH, a new assay was conducted, involving transgenic mice that expressedanti-VP6 VHH 2KD1+3B2 in maternal milk regulated under the MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) promoter. In this case, four-day old mice were inoculated with a lower dose of murine RVA (800 DD50) given that VHH levels in maternal milk were lower than in oral treatment experiments. Four litters of transgenic mice fed by transgenic dams were used and four litters of wild type micefed by wild type dams were employed as control. In order to discard that the transgenesis per secould have an effect on the development of RVA disease, a cross- fostering assay was conducted. In this case transgenic pups were fed by wild type dams and vice versa. Neonatal transgenic micefed by transgenic mothers showed lower severe diarrhea prevalence than the wild type control at PID 3, 4 and 7 and by PID 8 all mice in this group had resolved the symptoms completely. Pupsnursed by transgenic dams also reduced intestinal infection with RVA and viral shedding in feceswhen compared with the control. Regarding cross-fostering experiments, the obtained results wereinconsistent. Although mice nursed by transgenic dams successfully reduced diarrhea prevalencewhen compared with mice nursed by wild type dams, as expected, they showed higher intestinalinfection and higher fecal shedding. To establish if oral administration of anti-VP6 VHH represents an improvement regardingcurrent clinical management of RVA-associated diarrhea, a last experiment in the neonatal mousemodel was conducted to compare the efficacy of the VHH against two synthetic drugs (nitazoxanide, Bismuth salicylate) and two aromatic herbal compounds used in folk medicine for thetreatment of diarrhea (Aloysa citrodora, Piper aduncum): 2KD1+3B2 (50 mg/kg) + ORS; 2KD1(50mg/kg) + ORS, nitazoxanide (15 mg/kg), Bismuth salicylate (750 mg/kg), A. citrodora (infusion, 2g/kg); P. aduncum (infusion, 2 g/kg). In this case, anti-VP6 VHH were administered with ORS giventhat the addition increases proteolytic resistance to gastric enzymes. Four-day old mice wereinoculated with 1778 DD50 of murine RVA and assessed daily as described before. The obtainedresults showed that, with the exception of mice treated with nitazoxanide, all other treatmentsachieved a significant reduction in diarrhea duration and severity when compared with the untreatedcontrol. Regarding intestinal RVA titers, mice administered with anti-VP6 VHH, Bismuth salicylateand nitazoxanide diminished the severity of the infection whereas mice treated with aromatic herbsshowed no improvement. Similarly, fecal RVA shedding was only significantly reduced in micereceiving VHH and nitazoxanide but not those treated with other compounds. Our findings show that oral administration of anti-VP6 VHH constitute, not only an effectiveprophylactic treatment against RVA-associated diarrhea, but also a safe and effective therapeutictool against RVA infection, even once diarrhea is present. These results suggest that oraladministration of anti-VP6 VHH represents a significant improvement in the therapeutic treatment of RVA-associated diarrhea when compared with current available options. Anti-VP6 VHH could beused as a complement to ongoing vaccination, especially in populations that have shown lowerimmunization efficacy. Overall, oral therapy using anti-VP6 VHH has enormous potential to beimplemented in developing countries, where RVA mortality is still high and current vaccines seemless efficacious, and also to be administered to prematurely born or immunosuppressed childrenworldwide.
Citación:
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Maffey, Lucía. (2016). Prevención y tratamiento de Rotavirus A mediante nanoanticuerpos VHH anti-VP6. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6110_Maffey
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Maffey, Lucía. "Prevención y tratamiento de Rotavirus A mediante nanoanticuerpos VHH anti-VP6". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2016.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6110_Maffey
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