Loci de caracteres cuantitativos (QTLs) de la soja (Glycine max L. Merr) asociados a su capacidad de nodular y fijar nitrógeno

Salvucci, Rubén Darío

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	biologia
Título:	Loci de caracteres cuantitativos (QTLs) de la soja (Glycine max L. Merr) asociados a su capacidad de nodular y fijar nitrógeno
Título alternativo:	Quantitative trait loci (QTLs) associated to nodulation capacity and nitrogen fixation in soybean (Glycine max L. Merr)
Autor:	Salvucci, Rubén Darío
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Universidad Nacional de La Plata. Instituto de Fisiología Vegetal
Publicación en la Web:	2015-12-04
Fecha de defensa:	2015-06-26
Fecha en portada:	2015
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Director:	Balatti, Pedro A.
Director Asistente:	Aulicino, Mónica B.
Consejero:	Confalonieri, Viviana
Jurado:	Schrauf, Gustavo; López, César; Greizerstein, Eduardo
Idioma:	Español
Palabras clave:	SOJA (GLYCINE MAX); BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM; MARCADOR MOLECULAR; ANALISIS DE MAPEO DE QTLS; NODULACION; FIJACION BIOLOGICA DE NITROGENOSOYBEAN (GLYCINE MAX); BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM; MOLECULAR MARKER; QTL MAPPING ANALYSIS; NODULATION; BIOLOGICAL NITROGEN FIXATION
Tema:	biología/fisiología vegetal biología/genética
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5785_Salvucci
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n5785_Salvucci.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n5785_Salvucci
Ubicación:	Dep.BIO 005785
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Salvucci, Rubén Darío. (2015). Loci de caracteres cuantitativos (QTLs) de la soja (Glycine max L. Merr) asociados a su capacidad de nodular y fijar nitrógeno. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5785_Salvucci

Resumen:

La soja (Glycine max L. Merr) es la leguminosa más importante cultivada a nivelmundial y en Argentina que, junto con Estados Unidos y Brasil, son los paises quelideran la producción y el comercio de esta oleaginosa. Para obtener materiales conaltos rendimientos en las producciones agrícolas, el N se incorpora por medio de lafertilización química y/o biológica. Esta última tiene ventajas por sobre la fertilizaciónquímica ya que presenta menores riesgos para la contaminación del medio ambiente ycontribuye a un manejo sustentable. Ésta consiste en adicionar bacterias del suelo Gram (-) del género Bradyrhizobium que tienen la capacidad de interaccionar con lasraíces de la planta, como resultado de lo cual, desarrollan estructuras denominadosnódulos, en los cuales la bacteria fija nitrógeno. La soja usa casi todo el nitrógeno fijadoen la producción de granos. Las compañías de inoculantes se han focalizado enproducir formulados con cepas de bacterias seleccionadas que fijen más eficientementeel N y que puedan ser utilizadas en una amplia variedad de leguminosas. Sin embargo,el foco del mejoramiento en leguminosas ha sido principalmente el rendimiento y laresistencia a factores abióticos y bióticos. Desde 1950 se han caracterizado variosgenes involucrados en el reconocimiento de las señales disparadas por los rizobios y lasdistintas etapas de la infección y nodulación. Sin embargo, los caracteres capacidad denodulación y de fijación biológica de nitrógeno (FBN) presentan una arquitecturagenética compleja, y además depende de la interacción planta-bacteria y del ambiente. Debido al gran tamaño y complejidad del genoma de la soja, todavía resta identificargenes de la planta involucrados en la nodulación y fijación de nitrógeno. Por lo tanto, enel objetivo del presente trabajo de tesis fue identificar a los loci de caracterescuantitativos (QTLs) asociados a la capacidad de nodulación de la soja, de manera dedisponer de la información y de los marcadores moleculares que permitan mejorar alhospedante en lo que hace a la nodulación y por ende a la fijación de nitrógeno. Paraello se analizó la habilidad de 31 cultivares comerciales argentinos de soja paradesarrollar nódulos cuando estos fueron inoculados con una mezcla de las cepas Bradyrhizobium japonicum SEMIA 5079 (CPAC 7) y SEMIA 5080 (CPAC 15). Losexperimentos se realizaron en condiciones controladas de luz y temperatura. Seutilizaron para evaluar la capacidad de nodulación tres variables cuantitativas: númerode nódulos (NN), peso seco de nódulos (PSN) y peso seco de la parte aérea de laplanta (PSA). Los resultados permitieron seleccionar cultivares con alta, media y bajacapacidad de nodulación. En un segundo experimento se confirmó la respuestadiferencial para la capacidad de nodulación y en un tercer experimento se comprobóque la capacidad de nodulación no es dependiente de la cepa inoculada ya que loscultivares de alta y baja capacidad de nodulación mostraron el mismo fenotipo cuandofueron inoculados con la estirpe E109. Los cultivares con alta capacidad de nodulartuvieron el doble de nódulos que aquellos con menor capacidad, confirmando resultadosde trabajos previos. Además, se demostró la existencia de una variabilidad fenotípicaamplia para las variables estudiadas. Los resultados señalaron valores medianos a altosde heredabilidad H2, siendo la variable NN la que denotó mayor variabilidad genética. Larespuesta de la planta a la inoculación con una concentración determinada de bacteriasestuvo condicionada al número de bacterias inoculadas. Un aumento en laconcentración de células bacterianas resultó en un incremento del número de nódulos,hasta una concentración umbral, por encima de la cual la nodulación fue inhibida, lo queprobablemente esté vinculado al mecanismo de “quorum sensing”. Esto último seobservó tanto en los dos cultivares de alta como en los dos de baja capacidad denodulación. La densidad celular de los rizobios no alteró la respuesta al comparar loscultivares a la inoculación. Luego se procedió a caracterizar la diversidad genética delos cultivares argentinos de alta y baja capacidad de nodulación por medio de SSRsligados a QTLs asociados a nodulación en cultivares brasileros. Se determinó laasociación de estos marcadores con la capacidad de nodulación y otras característicasagronómicas de los cultivares de soja y se identificó la generación parental concapacidad de nodulación contrastante para que a partir del cruzamiento entre ellas seobtenga poblaciones segregantes aplicables al análisis de QTLs. Se encontrópolimorfismo para 10 marcadores SSR. En los cultivares argentinos e encontróasociación entre la capacidad de nodulación y los marcadores SSR definidos por loscultivares brasileros. Metodologías de análisis multivariados permitieron tomar ladecisión de seleccionar un cultivar de alta nodulación (NA 5485 RG) y uno de bajanodulación (A 7053 RG). Éstos fueron los parentales que se utilizaron para generar lapoblación segregante F2:3 como población de mapeo. En la generación F2 se realizó elgenotipado de los individuos a partir de ADN foliar con un “screening” de 221marcadores SSR a lo largo del genoma de los cuales sólo 36 fueron polimórficos. Seconstruyó un mapa genético parcial conteniendo 5 grupos de ligamiento. El fenotipadose realizó sobre 94 familias F3 en un ensayo de nodulación en condiciones controladasde luz y temperatura y se evaluaron los caracteres cuantitativos que definen lacapacidad de nodulación: número de nódulos (NN), peso seco de nódulos (PSN) y pesoseco de nódulo por nódulo (PSNN) calculado como PSN/NN. También otros caracteresrelacionados con el crecimiento de la planta fueron considerados: la biomasa seca dehojas (PSH) y biomasa seca de tallo (PST) y la suma de ambas, peso seco de la parteaérea (PSA). Se realizó un análisis de correlaciones entre las variables y de coeficientesde paso. A partir de una matriz básica combinada con los datos genotípicos (SSR) yfenotípicos se realizó finalmente el análisis mapeo de QTLs para estos caracteresmediante tres metodologías: por locus simple (ANOVA y regresión), por intervalo (SIM)e intervalo compuesto (CIM). Los resultados encontrados para la mayoría de los QTLs ysus efectos génicos coincidieron en general por los dos primeros métodos. Se pudoconfirmar que el QTL Satt414 se asoció a NN y PSN (locus simple). Se concluyó que lasvariables asociadas a capacidad de nodulación en la población F3, presentaron altosvalores de varianza genética y heredabilidad. Se localizaron QTLs para las variablesestudiadas que explicaron valores mayores al 15% de la varianza fenotípica total de lapoblación segregante. Se observó una segregación transgresiva para la mayoría de lasvariables asociadas a capacidad de nodulación. Se probó asociación en acoplamientoentre variables relacionadas con la capacidad de nodular y el aumento de la biomasa. Para caracteres de capacidad de nodulación, se localizaron QTLs en los siguientesgrupos de ligamiento: GL H para NN; PSN y PSNN; GL D1b para NN; GL A2 para NN; GL J para NN y PSN; GL B2 para PSN y PSNN; GL B1 para PSNN, GL C1 para PSNN. Estos QTLs explicaron entre 12.2-13.4% de la variación fenotípica total. Para caracteresde biomasa, relacionados con la FBN, se localizaron QTLs en los siguientes grupos deligamiento: GL H para AP y PST; GL M para AP. GL D1b para AP, PST, PSA y PSH; GL B2 para AP; GL N para PSA. GL L para PSA; GL G para PSH. Estos QTLs explicaronentre 8.3-25.6% de la variación fenotípica total. Si bien la metodología aplicada permitiólocalizar algunos QTLs de nodulación en intervalos. Estas regiones deberían saturarsecon otros marcadores de mayor eficiencia y variabilidad como los SNPs. Una mayorsaturación conjuntamente con la información disponible sobre el genoma de la soja y losbancos de ESTs permitirán identificar genes candidatos relacionados con el carácter enestudio. Estos resultados aportan herramientas útiles como punto de partida pararealizar mejoramiento asistido por marcadores para la capacidad de nodular y fijarnitrógeno en soja promoviendo rendimientos superiores bajo una agriculturasustentable. Palabras clave: Soja (Glycine max), Bradyrhizobium japonicum, marcador molecular,análisis de mapeo de QTLs, nodulación, fijación biológica de nitrógeno.

Abstract:

Soybean (Glycine max L. Merr) is the most important legume cultivatedworldwide. Argentina, Brazil and USA are the most important countries in terms ofproduction and exports of soybean products. In order to make get the most of theproduction potential of soybean cultivars, N is incorporated by chemical and/or biologicalfertilization methods. The latter is aimed at using Biological Nitrogen Fixation (BNF) thathas an advantage over the chemical fertilization since it reduces the risks ofenvironmental pollution and contributes to a sustainable agriculture. BNF is the result ofthe plant rizobia interaction, because of this a biotechnological process was developedand is known as inoculation. It consists in adding Gram-negative soil bacteria from thegenus Bradyrhizobium that has the ability to interact with the soybean root, to the plantthat as a result of this develops structures known as nodules, where bacteria fix nitrogen. In soybean almost most of the nitrogen fixed biologically is used by the plant growththerefore production is improved. Companies improved nitrogen fixation by developingformulations containing bacteria. selected based on its outstanding efficiency to fixnitrogen in an interaction with a wide array of cultivars and/or legume species. However,on the plant side breeding programs have been focused mostly in improving yield andresistance to biotic and abiotic factors. Starting in 1950, several genes that are involvedin rhizobia-soybean interactions have been characterized. However, the ability ofsoybean cultivars to nodulate and fix nitrogen has a complex genetic architecture thatdepends on plant-bacterial and environment interactions. The size and complexity of thesoybean genome, delayed the identification of plant genes involved in nitrogen fixation. Therefore the aim of this work was to identify quantitative trait loci (QTLs) associated tothe ability of soybean to develop nodules, as well as to identify molecular markersassociated to this trait. I analyzed the nodulation ability of 31 Argentinian commercialsoybean cultivars which were inoculated with a mixture of Bradyrhizobium japonicumstrain SEMIA 5079 (CPAC 7) and SEMIA 5080 (CPAC 15). The results allowed me toclassify cultivars in high, medium and low nodulating cultivars. In a second experiment, asubset of the already analyzed cultivars was selected for further analysis and theirresponse to inoculation was confirmed. In a third experiment, four cultivars two with highand two with low nodulation capacity were inoculated with another bacterial strain, B.japonicum E109 (recommended by INTA for the soybean crop in Argentina). Cultivarsresponded like in previous experiments suggesting that the response was governed bythe plant genome. Cultivars with high nodulation ability doubled the number of nodulesdeveloped by low nodulating cultivars. Heritability was estimated (H2) for the nodulenumber (NN), nodule dry weight (NDW) and shoot dry weight (SDW) and the resultsshowed that the values of heritability was either medium or high and that NN was themost variable genetic trait. Soybean cultivars, whether with low or high nodulationcapacity, increased nodulation as the concentration of bacteria in the inoculum increasedthough this occurred till a threshold value, decreasing thereafter. Probably nodulationwas inhibited by a "quorum sensing" mechanism. Then we analyzed the genetic diversityof Argentinian soybean cultivars by means of SSR markers linked to QTLs linked tonodulation capacity. In addition to this, also the association between markers withnodulation capacity and other agronomic traits was studied and cultivars with contrastingnodulation capacity were identified, to cross them and in order to get a segregatingpopulation for QTL analysis. It was found that 10 SSR loci were polymorphic among Argentinian cultivars and that NN, NDW and SDW were associated to SSR markerspreviously described in Brazilian cultivars. Cultivar NA 5485 RG (high nodulating) andcultivar A 7053 RG (low nodulating) were selected as parents to generate the mappingpopulation F2:3. Genotyping was carried out in the F2 generation. Genomic DNA wasscreened 221 SSR loci along the whole soybean genome. Among them only 36 werepolymorphic. A partial genetic map was constructed containing 5 linkage groups. Phenotyping was carried out over 94 families (F3) in a nodulation essay with light andtemperature controlled conditions and quantitative traits that define the nodulationcapacity: nodule number (NN), of nodule dry weight (NDW) and nodule dry weight pernodule (NDWN) calculated as NDW/NN. Other traits related to plant growth also wereconsidered in the analysis: leaves dry biomass (LDB) and stem dry biomass (SDB) andthe sum of both, shoot dry weight (SDW) and plant height (PH). A matrix with genotypicand phenotypic data was constructed and QTL mapping analysis was performed bythree methods: single marker (ANOVA and regression), interval mapping (IM) andcomposite interval mapping (CIM). Satt414 locus was confirmed as QTL associated with NN and NDW (single marker). It was concluded that the variables associated withnodulation capacity in the F3 population presented high values of genetic variance andheritability. Identified QTLs for studied variables explained values higher than 15% of thephenotypic variance. A transgressive segregation was observed for most of the variablesassociated with nodulation capacity. In addition I also found that variables related to thenodulation capacity and biomass were associated. QTLs associated to nodulationcapacity were located in linkage group GL H for NN; NDW and NDWN; GL D1b for NN; GL A2 for NN; GL J for NN and NDW; GL B2 for NDW and NDWN; GL B1 for NDWN, GL C1 for NDWN. These QTLs explained 12.2-13.4 % of the phenotypic variation. QTLsrelated to growth and biomass were located in the following linkage groups: GL H for PHand SDB; GL M for PH. GL D1b for PH, SDB, SDW and LDB; GL B2 for PH; GL N for SDW; GL L for SDW and GL G for LDB. These QTLs explained 8.3-25.6% of thephenotypic variation. The applied methodology allowed me to locate a few QTLs fornodulation in intervals. However, these regions should be saturated with more and/orother molecular markers with better efficiency and variability as e.g. SNPs. A higher levelof saturation as well as the information regarding the soybean genome sequence and EST's should help in the identification of genes related to nodulation and nitrogenfixation. To my knowledge this is the first work aimed at identifying nodulation andnitrogen fixation genes in soybean cultivars from Argentina and provide the starting pointfor marker assisted selection for nodulation capacity and nitrogen fixation in soybean inorder to promote better yields under a sustainable agriculture. Keywords: Soybean (Glycine max), Bradyrhizobium japonicum, molecular marker, QTLmapping analysis, nodulation, biological nitrogen fixation.

Citación:

---------- APA ----------

Salvucci, Rubén Darío. (2015). Loci de caracteres cuantitativos (QTLs) de la soja (Glycine max L. Merr) asociados a su capacidad de nodular y fijar nitrógeno. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5785_Salvucci

---------- CHICAGO ----------

Salvucci, Rubén Darío. "Loci de caracteres cuantitativos (QTLs) de la soja (Glycine max L. Merr) asociados a su capacidad de nodular y fijar nitrógeno". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2015.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5785_Salvucci

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