Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Nuevas estrategias para el diagnóstico de la tuberculosis y paratuberculosis bovina |
| Título alternativo: | New strategies for the diagnosis of bovina tuberculosis and paratuberculosis |
| Autor: | Mon, María Laura |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología
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| Publicación en la Web: | 2015-09-29 |
| Fecha de defensa: | 2015-03-27 |
| Fecha en portada: | 2015 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |
| Director: | Romano, María Isabel |
| Director Asistente: | Santangelo, María de la Paz |
| Consejero: | García, Verónica |
| Jurado: | Jacobsen, Mónica; Sasiain, María del Carmen; Laderach, Diego J. |
| Idioma: | Español |
| Tema: | biología/inmunología
biología/biotecnología
química/química biológica
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| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5736_Mon |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n5736_Mon.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n5736_Mon |
| Ubicación: | Dep.QUI 005736 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Mon, María Laura. (2015). Nuevas estrategias para el diagnóstico de la tuberculosis y paratuberculosis bovina. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5736_Mon |
Resumen:
La Tuberculosis (TBB) y Paratuberculosis bovina (PTB) son las principales enfermedades que limitanel desarrollo de la industria lechera y de la carne en Argentina, siendo importantes en el contexto de la Sanidad animal debido a las grandes pérdidas económicas que producen en el ganado bovino. La TBB es producida por M. bovis. El hospedador primario es el bovino, pero otras especies de interéseconómico, así como también especies salvajes se infectan con esta micobacteria. La TBB esconsiderada una de las zoonosis más importantes en Argentina, siendo más expuestos los trabajadoresrurales y de frigorífico, así como, los que consumen leche cruda sin pasteurizar. No existen vacunascomerciales contra la TBB, por lo tanto disponer de métodos de diagnóstico confiables para laidentificación de los animales enfermos es esencial. La prueba oficial de diagnóstico más empleada,aprobada por el SENASA, es la intradermoreacción (IDR) con PPD-B, la cual consiste en lainoculación intradérmica de un derivado proteico purificado de la cepa de M. bovis AN5 (PPD-B), y laposterior medición de la reacción de hipersensibilidad retardada producida. La PPD-B es una mezcla decomponentes, principalmente proteínas y lípidos de M. bovis. El principal inconveniente de la IDRradica en que algunas proteínas presentes en la PPD-B se encuentran en otras micobacterias, lo cualdisminuye la especificidad, ya que animales sensibilizados por exposición previa a otras micobacteriastambién responden a este reactivo. En la última década se desarrollaron nuevas pruebas para eldiagnóstico de tuberculosis, la más difundida consiste en la medición de IFN- luego de la estimulaciónde linfocitos con PPD-B o antígenos específicos de M. bovis. Otro método utilizado para el diagnósticode TBB es la prueba de ELISA, sin embargo esta sólo permite detectar animales en estados severos dela enfermedad o en estado de anergia. Por otro lado, la PTB es una enfermedad infecciosa, producida por M. avium subsp. paratuberculosis (MAP), la cual se caracteriza por una enteritis crónica que resulta en un deterioro progresivo del animalenfermo. Afecta principalmente al ganado bovino, ovino y caprino. El diagnóstico de certeza de PTB esel aislamiento de MAP, pero este es un microorganismo de crecimiento muy lento. Por estas razones,los métodos inmunológicos para el diagnóstico de PTB resultan más efectivos para aplicar en unacampaña de erradicación de la enfermedad que el cultivo. El diagnóstico inmunológico de PTB esprincipalmente serológico debido a que en estadios tempranos de la enfermedad se detectananticuerpos. Contrariamente a lo que sucede con TBB, el diagnóstico serológico en PTB permitedetectar con mayor especificidad los animales infectados que las pruebas que miden respuesta celular. Actualmente hay varios kits comerciales serológicos disponibles con diferentes antígenos, pero estoshan demostrado discrepancia en la capacidad de ser detectados por todos los animales infectados. También hay vacunas comerciales disponibles para PTB, pero estas no son utilizadas en nuestro paísdebido a que interfieren con el diagnóstico de TBB. Por lo mencionado, en este trabajo se identificaron y evaluaron antígenos específicos de M. bovis y MAP para mejorar el diagnóstico de ambas enfermedades y poder contar en el futuro con herramientasque permitan la utilización de vacunas en desarrollo para la erradicación de la TBB y PTB. Para este fin, se identificaron por técnicas de proteómica, antígenos en aquellas fracciones proteicasmás inmunogénicas de la PPD-B. A partir de las proteínas identificadas, se evaluaron 2 mezclas deantígenos altamente inmunogénicos identificados ya en trabajos previos en nuestro laboratorio, ESAT- 6, CFP-10, MPB-83, MPB-70, HSPX y TB10.3. Además de ser altamente inmunogénicos ESAT-6 y CFP-10 tienen la ventaja de que no se encuentran en la vacuna BCG, con lo cual son útiles para undiagnóstico DIVA (diferenciando vacunados de infectados). Estas mezclas resultaron ser másespecíficas que la PPD-B al no ser detectadas por animales vacunados con BCG, ni animales con PTBo sanos. Para mejorar la sensibilidad de estas mezclas se incluyeron otras proteínas identificadas en esteestudio, no estudiadas hasta el momento: FixB y CFP2. Las nuevas mezclas incluyendo a estasproteínas, fueron evaluadas por las técnicas de IFN- e IDR, en animales naturalmente infectados con M. bovis, animales con PTB y animales sanos. En base a estos resultados, se observó que FixBaumentó la sensibilidad de las mezclas sin comprometer la especificidad. Luego estas mezclas fueronevaluadas en una prueba serológica, siendo detectadas también específicamente por los sueros deanimales infectados con M. bovis. Nuestros resultados demuestran que una nueva mezcla compuestapor las proteínas recombinantes CFP-10, ESAT-6, MPB83 y FixB, es un promisorio nuevo reactivopara aplicar al diagnóstico específico de TBB tanto celular como serológico, sin interferencias conanimales sensibilizados con otras micobacterias o vacunados con BCG. En cuanto la evaluación de antígenos de MAP para utilizar en el diagnóstico de PTB, se evaluó unpanel de 51 antígenos por la técnica de MAPIA. Esto permitió seleccionar 7 antígenos específicos: Map2513, Map1693c, Map2020, Map0038, Map1272, CSP, Map0210c, los cuales fueron detectadosespecíficamente por los sueros de animales con PTB. En base a esto, se realizó una mezcla con los 7antígenos (M1-PTB), la cual se evaluó también por MAPIA. Por otra parte se identificaron proteínas antigénicas a partir de PPD-A (Derivado proteico purificado apartir de M. avium por técnicas de proteómica identificándose 3 proteínas las cuales también seevaluaron por la técnica de MAPIA, conformando una segunda mezcla (M2-PTB). esta mezcla resultósensible, pero no específica. Luego M1-PTB y M2-PTB fueron evaluadas con mayor cantidad desueros de animales con PTB y con un grupo de animales con TBB por la técnica de ELISA,comparando con el ELISA convencional PPA-3 que utiliza un antígeno protoplasmático de MAP. M1- PTB tuvo sensibilidad del 33% y no exhibió reacción cruzada con sueros de animales sanos y lareactividad con el suero de animales con TBB fue muy baja mostrando una mayor especificidad que el ELISA-PPA-3. El panel de 51 antígenos también fue evaluado por la técnica de IFN-ningún antígenode MAP demostró capacidad de liberar esta citoquina en valores que permitan su utilización en un testque mida respuesta celular. Los resultados presentados en este trabajo sugieren que varios antígenos específicos tanto de M. boviscomo de MAP pueden mejorar la detección de la infección pudiendo permitir además el uso de vacunastanto contra PTB como TBB, sin que estas interfieran en el diagnóstico.
Abstract:
Tuberculosis (TBB) and bovine paratuberculosis (PTB) are the main diseases that limit thedevelopment of dairying and beef in Argentina, being important in the context of animalhealth, due to the large economic losses that occur in cattle. TBB is produced by M. bovis. The primary host is cattle but other species of economicinterest as well as wild species are infected with this mycobacterium. TBB is consideredone of the most important zoonoses in Argentina where rural workers and those whoconsume raw unpasteurized milk are primarily exposed. There are no commercial vaccinesagainst TBB therefore having reliable diagnostic methods its essential. The officialdiagnostic test, approved by SENASA is the tuberculin test (IDR), which involvesintradermal inoculation of a purified protein derivative of M. bovis strain AN5 (PPD-B),and subsequent measuring of the delayed hypersensitivity reaction. PPD-B is a mixture ofcomponents, proteins and lipids from M. bovis. The main disadvantage of the IDR is thatsome proteins present in the PPD-B are in others mycobacteria, which decreases thespecificity, since animals sensitized by previous exposure to other mycobacteria alsorespond to this reagent. In the last decade, new tests for the diagnosis of tuberculosis weredeveloped; the most widespread is the measurement of IFN- after lymphocyte stimulationwith PPD- B or specific M. bovis antigens. Another method used for TBB- diagnosis is the ELISA, but this only allows detecting anergic animals in severe disease states. Furthermore, PTB is an infectious disease caused by M. avium subsp. paratuberculosis (MAP), which is characterized by chronic enteritis resulting in a progressive deteriorationof the animal. Primarily affects cattle, sheep and goats. Definitive diagnosis of PTB is theisolation of MAP, but this is a very slow growing organism. For these reasons,immunological methods for PTB diagnosis are more effective to implement in a campaignto eradicate the disease than culture. Immunological PTB diagnosis is primarily serologicbecause in the early stages of the disease antibodies are detected. Contrary to what happenswith TBB, serological PTB diagnosis has a greater specificity to detect infected animalsthan cellular response test. Currently, several serological commercial kits are available withdifferent antigens, but these have shown discrepancy in the ability to detect all infectedanimals. There are also commercial PTB-vaccines available, but these are not used in ourcountry because they interfere with TBB diagnosis. In this study M. bovis and MAP specific antigens were identified and evaluated to improvethe diagnosis of both diseases and to have tools in the future that allow the use of vaccinesin development for the eradication of TBB and PTB. For this purpose, antigens were identified by proteomic techniques in those immunogenic PPD-B protein fractions. From this, 2 mixtures composed by highly immunogenic antigens identified in previous studies in our laboratory, ESAT-6, CFP-10, MPB-83, MPB-70, HSPX and TB10.3, were evaluated. Besides, being highly immunogenic ESAT-6 and CFP- 10 have the advantage of not to found in BCG, thereby serve as a diagnostic DIVA (differentiating vaccinated from infected). These mixtures were more specific than PPD-Bnot reacting with BCG-vaccinated animals, or PTB-infected or healthy animals. Toimprove the sensitivity of these cocktails, two unknown proteins, CFP2 and FixB wereincluded. These new cocktails were evaluated by IFN- release assay and IDR. Based onthese results, it was observed that FixB increased the sensitivity without compromising thespecificity. Our results demonstrate that a novel mixture comprising the recombinantproteins CFP-10, ESAT-6, MPB83 and FixB, is a promising new reagent for specificdiagnosis applied to both cellular and serological TBB without interference with othermycobacteria sensitized animals. Thus, the mixture can be used for diagnosis of TBB, andalso applied in BCG vaccinated animals without interfering. As the evaluation of MAP antigens for PTB-diagnosis, a panel of 51 antigens wasevaluated by MAPIA (multi-print antigen immunoassay). This allowed selecting 7 specificantigens: Map2513, Map1693c, Map2020, Map0038, Map1272, CSP, and Map0210c. Based on this, a mixture with the seven antigens (M1-PTB) was performed, which was alsoevaluated by MAPIA. Moreover, PPD-A antigenic proteins were identified by proteomic techniques. Threeproteins from these were also evaluated by the technique of MAPIA, forming a secondmixture (M2 -PTB). After this, both cocktails were evaluated with greater amount of sera from MAP and M.bovis infected animals by ELISA, comparing with conventional ELISA-PPA-3 using a M.avium protoplasmic antigen. M1-PTB had a sensitivity of 33% and exhibited no crossreactionwith healthy animals and the reactivity of TBB animals was very low, being morespecific than ELISA-PPA-3. The panel of 51 antigens was also evaluated by the techniqueof IFN-any antigen was very inmunogenic to allow their use in a test to measure cellularresponse. The results presented in this thesis suggest that several specific M. bovis and MAP antigenscan improve the detection of infection and also allow the use of vaccines for both PTB as TBB, without interfering with the diagnosis.
Citación:
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Mon, María Laura. (2015). Nuevas estrategias para el diagnóstico de la tuberculosis y paratuberculosis bovina. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5736_Mon
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Mon, María Laura. "Nuevas estrategias para el diagnóstico de la tuberculosis y paratuberculosis bovina". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2015.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5736_Mon
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