Ecotoxicología del arsénico y mecanismos de acción en el desarrollo del anfibio Rhinella arenarum

Mardirosian, Mariana Noelia

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Ecotoxicología del arsénico y mecanismos de acción en el desarrollo del anfibio Rhinella arenarum
Título alternativo:	Ecotoxicology of arsenic and mechanisms of action in the development of the amphibian Rhinella arenarum
Autor:	Mardirosian, Mariana Noelia
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Universidad Nacional del Comahue. Facultad de Ingeniería. Departamento de Química. Laboratorio de Investigaciones Bioquímicas y Químicas del Ambiente
Publicación en la Web:	2015-07-14
Fecha de defensa:	2015-03-10
Fecha en portada:	2014-12
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Director:	Venturino, Andrés
Director Asistente:	Bongiovanni, Guillermina Azucena
Consejero:	Wolansky, Marcelo Javier
Jurado:	Ferrari, Lucrecia; Menone, Mirta L.; Castro, Gerardo D.
Idioma:	Español
Palabras clave:	RHINELLA ARENARUM; ARSENICO; ECOTOXICIDAD; ESTRES OXIDATIVO; SISTEMA ANTIOXIDANTE; VIAS DE SEÑALIZACION; BIOACUMULACIONRHINELLA ARENARUM; ARSENIC; OXIDATIVE STRESS; ANTIOXIDANT SYSTEM; SIGNALING PATHWAYS; BIOACCUMULATION; ECOTOXICITY
Tema:	biología/impacto ambiental biología/embriología animal biología/toxicología
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5664_Mardirosian
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n5664_Mardirosian.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n5664_Mardirosian
Ubicación:	Dep.QUI 005664
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Mardirosian, Mariana Noelia. (2014). Ecotoxicología del arsénico y mecanismos de acción en el desarrollo del anfibio Rhinella arenarum. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5664_Mardirosian

Resumen:

El arsénico (As) es un elemento natural de relevancia ecológica que seencuentra en fuentes naturales de agua en toda la Argentina enconcentraciones entre 0,001 y 15 mg/L. La especie autóctona de sapo Rhinellaarenarum fue seleccionada para estudiar la toxicidad sub-crónica y crónica delarsénico y las respuestas bioquímicas y moleculares provocadas por laexposición a este tóxico durante su desarrollo embrionario y larval, con elobjetivo de identificar biomarcadores moleculares y bioquímicos. El valor promedio de la CL50 fue de 24,27 mg As/L y se mantuvoconstante a lo largo del desarrollo embrionario. Sin embargo, cuando losembriones fueron expuestos a partir del estadio de “latido cardíaco” (5 días dedesarrollo), la toxicidad del arsénico disminuyó drásticamente, lo que sugiere laactivación de mecanismos de desintoxicación. El valor de NOEC arrojó unresultado de 10 mg As/L y el de LOEC (efecto: mortalidad) un valor de 20 mg As/L para los distintos experimentos. Dadas las concentraciones ambientalesde arsénico en Argentina, hay una probabilidad de exceder los niveles letalesen un 1 por ciento de los sitios. El valor de LOEC sería superado en el 1,3 porciento de los sitios, mientras que el de NOEC en el 3,5 por ciento de los sitiosen términos probabilísticos. El arsénico en concentraciones de 10 y 20 mg/L causó una disminuciónsignificativa en la capacidad antioxidante total (TRAP), pero generó un aumentoen el contenido de glutatión reducido (GSH) endógeno y en la actividad deglutatión S-transferasa (GST) cuando la exposición se realizó en forma subcrónicahasta el final del desarrollo embrionario. Esta respuesta protectorapodría estar impidiendo un descenso más profundo en el sistema antioxidante yun mayor daño oxidativo, o estar vinculado a la conjugación del arsénico con GSH para su excreción. Cuando la exposición a arsénico se realizó en formacrónica durante 23 días a concentraciones por debajo de 10 mg/L, se observóla inducción de las actividades de GST y glutatión reductasa (GR). Por suparte, el arsénico disminuyó la actividad de catalasa (CAT) en los estadiosembrionarios, mientras que la actividad de la glutatión peroxidasa Sedependienteno se vio afectada con la presencia del tóxico. Si bien se observóuna disminución de TRAP durante toda la exposición a 1 y 10 mg/L, no seobservó alteración en el contenido de GSH ni en los niveles de peroxidación delípidos. La actividad de superóxido dismutasa (SOD) se vio inducida a los 9 y 16 días e inhibida al final de la exposición, sugiriendo la inactivación de laenzima. Se detectó la misma tendencia en la expresión de las proteínas CAT, SOD y GST, analizadas por Western blot, que la observada en sus actividadesenzimáticas. Se estudiaron los efectos del arsénico sobre vías de transducción deseñales y factores de transcripción que podrían estar relacionados a sutoxicidad crónica. Las quinasas de la vía MAPK, MEK y ERK y los factores detranscripción c-FOS y c-JUN fueron inducidos por la exposición a arsénico,pudiendo estar modulando la respuesta antioxidante. Además, se evaluó la acumulación de arsénico y la concentración dehierro, zinc y cobre en embriones y larvas expuestos a arsénico. Los resultadosmostraron que los embriones expuestos crónicamente a 1 y 10 mg/Lacumularon arsénico a partir del día 5, mientras que los embriones expuestos a 0,01 y 0,1 mg/L lo hicieron entre el día 5 y el día 9 de desarrollo. Luego de 23días de exposición, se determinó una bioacumulación de arsénico de 27 vecesen el grupo expuesto a 0,01 mg/L, de 11 veces en el grupo expuesto a 0,1mg/L, de 44 veces en el grupo expuesto a 1 mg/L, y de solamente 5 veces enel grupo expuesto a 10 mg/L, tomando como referencia el arsénico presente enel medio. La bioacumulación se comportó de manera lineal en el tiempo de laexposición excepto para el valor más alto de 10 mg/L, concentración quepodría provocar la saturación de los sistemas de transporte. El arsénicoutilizaría el sistema de excreción de transportadores ABC según los estudios exvivo que realizamos sobre la actividad de proteínas de resistencia a múltiplesxenobióticos, MRP, las cuales transportan en forma fisiológica compuestosconjugados con GSH. Asimismo, se observó un aumento en lasconcentraciones de hierro, zinc y cobre en las larvas expuestas a arsénico,sugiriendo que el arsénico podría estar modulando la retención o acumulaciónde estos elementos dentro de las larvas expuestas. Los resultados obtenidos nos permiten concluir que los embriones de R.arenarum son más sensibles al arsénico durante las etapas tempranas deldesarrollo, probablemente debido a que se requiere la evolución demecanismos detoxificantes ligados a GSH; asimismo, altas concentraciones deeste elemento son necesarias para provocar la mortalidad cuando la exposiciónse realiza hasta el final del desarrollo embrionario. El arsénico es capaz dealterar el estado oxidativo en embriones y larvas de R. arenarum, afectando elestado redox celular a concentraciones subletales tanto en la exposición subcrónicacomo crónica, modulando la respuesta antioxidante a través de la víade MAPK por MEK y ERK y la acción de los factores de trascripción muytempranos c-FOS y c-JUN. El arsénico en concentraciones de hasta el ordende mg/L se bioacumularía en forma continua desde el medio, probablementedebido a su transformación enzimática a compuestos organoarsenicales, entreellos la conjugación con GSH para su excreción por MRP. Además, debido aque la actividad de las enzimas GR y GST, los niveles de proteínas de la vía de MAPK MEK y ERK y de los factores de transcripción c-FOS y c-JUN se vieron alterados a bajas concentraciones de arsénico, su respuesta puede serutilizada como marcador de exposición temprana a dicho tóxico.

Abstract:

Arsenic (As) is a natural element of ecological relevance that is found innatural water sources throughout Argentina in concentrations ranging between 0.001 and 15 mg/L. The autochthonous toad Rhinella arenarum was selected tostudy the sub-chronic and chronic toxicity of arsenic and the biochemicalresponses elicited by the exposure to this toxic in water during its embryonicand larval development, with the aim of identifying molecular and biochemicalbiomarkers. The LC50 value averaged 24.27 mg/L As, and remained constant alongthe embryonic development. However, arsenic toxicity drastically decreasedwhen embryos were exposed from “heartbeat” stage on (5 days ofdevelopment), suggesting the onset of detoxification mechanisms. The NOECyielded a value of 10 mg/L As, while the LOEC (effect: mortality) yielded a valueof 20 mg/L As for the different experiments. Given the environmentalconcentrations of arsenic in Argentina, there is a probability of exceeding lethallevels at one percent of the sites. The LOEC and NOEC values would beexceeded at 1.3 percent and 3.5 percent of the sites, respectively. Arsenic concentrations of 10 and 20 mg/L caused a significant decreasein the total antioxidant potential (TRAP), but generated an increase inendogenous GSH content and glutathione S-transferase (GST) activity whenthe exposure was performed sub-chronically until the end of the embryonicdevelopment. This protective response might prevent a deeper decline in theantioxidant system and further oxidative damage or it might be linked to arsenicconjugation with GSH for its excretion. When the exposure was performedchronically for 23 days at sublethal concentrations (below 10 mg/L), the toxicantcaused an induction of GST and glutathione reductase (GR) activities. However, catalase (CAT) activity was reduced by arsenic in embryonic stagesand glutathione peroxidase Se-dependent activity was not affected by thepresence of the toxicant. While a decrease in the total antioxidant potential wasobserved throughout the exposure at 1 and 10 mg/L, GSH content and lipidperoxidation levels did not differ from control. SOD activity was induced after 9and 16 days of exposure and inhibited at the end of exposure (23 days),suggesting the inactivation of the enzyme. Through Western blot analysis, thesame trend was found in the expression of the CAT, SOD and GST proteinswhen compared to their enzymatic activities. MEK and ERK pathway proteins and signal transduction transcriptionfactors c-JUN and c-FOS were studied, showing that arsenic induces theexpression of these proteins suggesting that they might be modulating theantioxidant response due to arsenic exposure. It was observed that embryos exposed chronically to arsenicconcentrations between 1 and 10 mg/L accumulate arsenic from day 5 on, andembryos exposed to 0.01 and 0.1 mg/L start accumulating arsenic between day 5 and day 9. After 23 days of exposure, bioaccumulation of arsenic was about 27-fold in the group exposed to 0.01 mg/L, 11-fold in the group exposed to 0.1mg/L, 44-fold in the group exposed to 1 mg/L, and only 5-fold in the groupexposed to 10 mg/L, when compared to the arsenic concentration present in themedium. Bioaccumulation of arsenic was linear along time of exposure exceptfor the highest value of 10 mg/L, suggesting that this concentration could lead tosaturation of transport systems. Arsenic would use the ABC transporterexcretion system according to our ex vivo studies on the activity of the multidrugresistance proteins, MRP, which transport compounds conjugated with GSH. Furthermore, an increase in the concentrations of iron, zinc and copper inlarvae exposed to arsenic was observed, suggesting that arsenic could bemodulating the retention or accumulation of these elements in the exposedlarvae. We conclude that R. arenarum embryos are more sensitive to arsenicduring early stages of development, probably because the development ofdetoxification mechanisms linked to GSH are necessary and that highconcentrations of this toxic element are required to cause mortality when theexposure is performed until the end of the embryonic development. Arsenic canalter the oxidative status in R. arenarum embryos and larvae, affecting thecellular redox state at sublethal concentrations in both sub-chronic and chronicexposures, modulating the antioxidant response via the MAPK pathway, bymeans of MEK and ERK, and through the action of very early transcriptionfactors, c-FOS and c-JUN. Arsenic at concentrations up to the order of mg/Lwould continuously be bioaccumulated from the medium, probably due to itsenzymatic conversion to organoarsenical compounds, including its conjugationwith GSH for excretion via MRP. Furthermore, due to the alteration of GR and GST enzymatic activities, and MEK, ERK, c-JUN and c-FOS levels at lowarsenic concentrations, their response can be used as an early marker ofexposure to this toxic.

Citación:

---------- APA ----------

Mardirosian, Mariana Noelia. (2014). Ecotoxicología del arsénico y mecanismos de acción en el desarrollo del anfibio Rhinella arenarum. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5664_Mardirosian

---------- CHICAGO ----------

Mardirosian, Mariana Noelia. "Ecotoxicología del arsénico y mecanismos de acción en el desarrollo del anfibio Rhinella arenarum". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2014.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5664_Mardirosian

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