Interacción de la proteína quinasa dependiente de cAMP con sus genes blanco en Saccharomyces cerevisiae

Baccarini, Leticia Cecilia

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Interacción de la proteína quinasa dependiente de cAMP con sus genes blanco en Saccharomyces cerevisiae
Título alternativo:	Interaction of cAMP-dependent Protein Kinase with its target genes in Saccharomyces cerevisiae
Autor:	Baccarini, Leticia Cecilia
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Biología Molecular y Transducción de Señales
Publicación en la Web:	2015-04-07
Fecha de defensa:	2014-03-20
Fecha en portada:	2014
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Director:	Portela, Paula
Consejero:	Moreno, Silvia
Jurado:	Correa García, Susana R.; Shayo, Carina Claudia; Ceccarelli, Eduardo Augusto
Idioma:	Español
Tema:	biología/biología molecular y celular biología/epigenética biología/bioquímica
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5535_Baccarini
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n5535_Baccarini.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n5535_Baccarini
Ubicación:	Dep.QUI 005535
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Baccarini, Leticia Cecilia. (2014). Interacción de la proteína quinasa dependiente de cAMP con sus genes blanco en Saccharomyces cerevisiae. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5535_Baccarini

Resumen:

La regulación de la expresión génica mediada por proteínas quinasas es esencial para lacorrecta adaptación celular frente a un estímulo extracelular. En S. cerevisiae, la PKA estáformada por tres subunidades catalíticas: Tpk1, Tpk2 y Tpk3 y una subunidad regulatoria: Bcy1. Existen antecedentes que indican la asociación de Tpk1 y Tpk2 a la cromatinadurante el crecimiento en glucosa, glicerol y estrés oxidativo (Pokholok et al, 2006). El rolde la vía cAMP/PKA sobre la expresión génica en glucosa ha sido ampliamente estudiado (Livas et al, 2011). Por otro lado, se ha descripto, que la activación de la PKA limita laexpresión de genes de respuesta a estrés (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). Durante el desarrollo de esta tesis analizamos la unión de Bcy1, Tpk1 y Tpk2 a diferentesregiones génicas en respuesta a estrés osmótico y oxidativo. Describimos que tanto lassubunidades catalíticas como la subunidad regulatoria de la PKA se encuentranasociadas tanto a regiones transcriptas como a promotores de los genes blancos demanera estrés-dependiente. Además analizamos el requerimiento de la actividad quinasay el papel de Bcy1 en la asociación de las Tpks a la cromatina. Versiones inactivas de Tpk1 y Tpk2 no se asociaron a la cromatina. La deleción de Bcy1 promueve una mayorasociación de Tpk1, mientras que anuló la asociación de Tpk2. Luego analizamos elposible rol de las Tpk en el remodelado de la cromatina en respuesta a estrés a través delanálisis de la cinética de unión de factores remodeladores de la cromatina a las regionesdonde encontramos asociadas a Tpk1 y Tpk2. Observamos unión transitoria a lacromatina de Arp8, Rsc1 y Snf2 seguido temporalmente por la asociación de las Tpk. Observamos también, la ocupación concomitante de Tpk2 y el factor de transcripción deunión al DNA Rap1. En conjunto los datos existentes y los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la PKA podría participar en la expresión génica mediante fosforilación in situ de losreguladores transcripcionales o de la cromatina. La distribución núcleo-citoplasmática permite regular la actividad diferencial de muchasproteínas quinasas. Hemos analizado la localización subcelular de las subunidades de PKA y su mecanismo de transporte durante estrés. Hemos observado que Tpk1-GFP y Tpk3-GFP acumulan en el núcleo post-estrés oxidativo y osmótico, sin embargo Tpk2- GFP y Bcy1-GFP no cambian su acumulación nuclear. El análisis cinético de laacumulación nuclear de Tpk1 mostró mayor velocidad en respuesta a estrés osmóticoversus oxidativo. Hemos determinado que la acumulación nuclear de Tpk1, Tpk2, Tpk3 y Bcy1 es unmecanismo de transporte activo. Sorprendentemente, cada una de las subunidades de PKA es importada al núcleo por diferentes carioferinas. Por otra parte, las cepasdefectivas en carioferinas las cuales impiden la acumulación nuclear específicamente de Tpk1 o Tpk2 no mostraron asociación a la cromatina las Tpks, lo que sugiere elrequerimiento de acumulación nuclear de las subunidades catalíticas para la asociación asus genes blancos.

Abstract:

Regulation of gene expression by intracellular stimulus-activated protein kinases isessential for cell adaptation to environmental changes. There are three PKA catalyticsubunits in S. cerevisiae: Tpk1, Tpk2 and Tpk3 and one regulatory subunit: Bcy1. Previousdata indicates that Tpk1 and Tpk2 were found associated to the chromatin during growthon glucose, glycerol and oxidative stress (Pokholok et al, 2006). Using ChIP-real timeassay we analyzed the Bcy1, Tpk1 and Tpk2 association to 5 genes regions in responseto osmotic and oxidative stresses. We had demonstrated that both catalytic and regulatorysubunits of PKA were associated to transcribed regions and promoters of target genes in astress dependent manner. Furthermore we analyze the requirement of kinase activity andthe role of Bcy1 protein on Tpk chromatin association. Inactive versions of Tpk1 and Tpk2do not associate to chromatin. Deletion of BCY1 promotes higher Tpk1 association,whereas it abolished Tpk2 association. We then analyze the possible role of Tpk onchromatin remodeling in response to stress conditions. We analyze the kinetics of bindingchromatin remodelers in the regions bound by Tpk1 and Tpk2 in response to stress. During stress stimulus there is a transient binding to chromatin of Arp8, Rsc1 and Snf2 -chromatin remodelers followed temporarily by Tpk association. We also observe cooccupancyof Tpk2 and DNA-binding transcription factor Rap1. The role of cAMP / PKA ongene expression in glucose has been extensively studied (Livas et al, 2011). However PKA activation limits the expression of stress responsive genes (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). These results suggest that PKA could participate in gene expressionby in situ phosphorylation of transcriptional or chromatin regulators. Actually it is known that a single protein kinase distributed dynamically between cytoplasmand nucleus, can regulate target genes expression by both nuclear and cytoplasmicsignaling mechanisms. Thus, the nucleus-cytoplasmic kinases transport would beimportant to regulate differential activity in both compartments. Here we analyze stresssubcellular localization of PKA subunits and their transport mechanism, using fluorescencemicroscopy. We observed that Tpk1 and Tpk3 accumulate in the nucleus post-oxidativeand osmotic stress however Tpk2 and Bcy1 not change their nucleus-cytoplasmicdistribution, staying preferentially nuclear. Our results over Tpk1 stress re-localizationkinetics suggest that under osmotic stress is necessary its faster nuclear accumulation. We determined that Tpk1, Tpk2, Tpk3 and Bcy1 nuclear accumulation is ATP dependentsuggesting an active transport mechanism. Surprisingly, we found that each PKA subunitsis transported into the nucleus by different karyopherins. Moreover, karyopherin mutantstrains which prevent nuclear accumulation of Tpk1 or Tpk2 prevented its association withchromatin, suggesting that nuclear accumulation of catalytic subunits to association totheir targets genes is required.

Citación:

---------- APA ----------

Baccarini, Leticia Cecilia. (2014). Interacción de la proteína quinasa dependiente de cAMP con sus genes blanco en Saccharomyces cerevisiae. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5535_Baccarini

---------- CHICAGO ----------

Baccarini, Leticia Cecilia. "Interacción de la proteína quinasa dependiente de cAMP con sus genes blanco en Saccharomyces cerevisiae". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2014.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5535_Baccarini

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