Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Caracterización de las etapas tempranas de la agregación de alfa-sinucleína in vitro mediante sondas fluorescentes ESIPT y microscopia de fuerza atómica |
| Título alternativo: | Characterization by fluorescent ESIPT probes and atomic force microscopy of early stages in the in vitro aggregation of alfa-synuclein |
| Autor: | Fauerbach, Jonathan Arturo |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Centro de Investigación en Hidratos de Carbono (CIHIDECAR)
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| Publicación en la Web: | 2014-07-04 |
| Fecha de defensa: | 2013 |
| Fecha en portada: | 2013 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Orgánica |
| Director: | Jares-Erijman, Elizabeth A.; Jovin, Thomas M. |
| Director Asistente: | Giordano, Luciana |
| Consejero: | Varela, Oscar |
| Jurado: | Erra-Balsells, Rosa; Delfino, José María; Tricerri, María Alejandra |
| Idioma: | Español |
| Palabras clave: | ALFA-SINUCLEINA; ENFERMEDAD DE PARKINSON; SONDAS FLUORESCENTES; ESIPT; AFM; CRIO-ET; OLIGOMEROS; INTERMEDIARIOS; AGREGACIONALPHA-SYNUCLEIN; PARKINSON´S DISEASE; FLUORESCENT PROBES; ESIPT; AFM; CRYO-ET; OLIGOMERS; INTERMEDIARIES; AGGREGATION |
| Tema: | biología/biomedicina
química/química biológica
química/química orgánica
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| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5357_Fauerbach |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n5357_Fauerbach.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n5357_Fauerbach |
| Ubicación: | Dep.QUI 005357 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Fauerbach, Jonathan Arturo. (2013). Caracterización de las etapas tempranas de la agregación de alfa-sinucleína in vitro mediante sondas fluorescentes ESIPT y microscopia de fuerza atómica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5357_Fauerbach |
Resumen:
La Enfermedad de Parkinson (EP) es el desorden neurodegenerativo motor más frecuente,caracterizado por la presencia de agregados proteicos amiloideos intra y extraneuronalesconocidos como Cuerpos de Lewy (CL). El principal componente de estas estructuras esalfa-sinucleína (AS), una proteína presináptica de 140 aminoácidos abundante en célulasdopaminérgicas del cerebro aunque su función fisiológica permanece aún desconocida. Ensu forma libre nativa AS carece de una estructura secundaria definida pudiendo adoptarmúltiples conformaciones en solución y en asociación con otras proteínas y membranas. Secree que los CL y las fibras amiloides maduras (mafs) son el resultado de un proceso demal plegamiento, auto-ensamblado y asociación de AS y que posiblemente sirven comomecanismos de protección para la célula, a través de la redistribución en la población de lasespecies tóxicas intermediarias solubles asociadas a etapas tempranas. Estudio in vitro delas especies y procesos involucrados en la agregación de AS brindan la posibilidad deentender los mecanismos subyacentes en EP. El diseño de nuevas formas de detección delas especies intervinientes en el proceso de agregación y el estudio de los mecanismos deformación de dichos intermediarios tempranos poseen una alta importancia. En esta tesis, se sintetizaron sondas fluorescentes sensibles a cambios en la polaridad desu microentorno que permiten monitorear el proceso de auto-ensamblado y asociación de AS marcada covalentemente con estos compuestos. Dichas sondas demuestran una muyalta sensibilidad al proceso en estudio, proveyendo una novedosa metodología demonitoreo en continuo con la mínima perturbación del sistema. Diversas sondas fueronsintetizadas basándose en la familia de las 3-hidroxicromonas (3HC), compuestosaltamente sensibles a los cambios de polaridad de su entorno. Su particular estructuraquímica posibilita el fenómeno conocido como ESIPT (‘Excited State Intramolecular Proton Transfer o Transferencia Protónica Intramolecular en el Estado Excitado’). En ESIPT seproduce una transferencia protónica intramolecular en el estado excitado obteniendo dosformas excitadas cada una con un nivel de energía distinto. Con lo cual estos compuestosfluorescentes ESIPT presentan dos bandas de emisión en lugar de una sola. La posición,intensidad y relación entre las bandas de emisión se modifican de acuerdo a los cambios enla polaridad, formación de enlaces por puentes de hidrógeno, y acidez/basicidad delmicroentorno de la sonda. Las nuevas sondas 3HC sintetizadas resultaron reporteros muyversátiles para el proceso de agregación de AS, particularmente sensibles a las etapastempranas a cuyos agregados de AS se les adjudica la mayor citotoxicidad. La combinaciónde distintas sondas de polaridad han permitido obtener datos experimentales acerca de laformación y desaparición de intermediarios pre-amiloideos transientes. Las curvas de agregación obtenidas y sus cambios espectroscópicos fueroncomplementadas con un análisis por Microscopia de Fuerza Atómica (AFM). Mediante unestudio sistemático por AFM se lograron identificar las diferentes especies provenientes delproceso de autoensamblado de AS, donde cada una de las especies fue caracterizada ycatalogada. Estudios a diferentes temperaturas permitieron evaluar su influencia en lacinética y termodinámica del proceso de agregación. Incubaciones a baja temperatura (4°C) permitieron definir un mínimo local de energía en la coordenada de la agregación,revelando una novedosa especie supramolecular (la "acuna") que muestra indicios de estardirectamente involucrada en el paso clave de la formación de estructuras fibrilares. Estudios preliminares sobre células SH-SY5Y en cultivo dan indicios de que las acunas soncitotóxicas. A través de la Crio-Microscopía de Transmisión Electrónica (Cryo-ET) se obtuvoinformación estructural con resolución sub-nm de esta novedosa especie supramolecular. Los estudios dieron lugar a la formulación de un nuevo esquema secuencial de agregación (SAS) para AS, basándose en conceptos de química coloidal, de polímeros ysupramolecular. SAS distingue 3 etapas de la agregación: molecular, coloidal y fibrilar, enfunción de las estructuras halladas, su orden secuencial lineal y orquestado deinterconversión, su presencia transiente (aparición y desaparición) y morfologíacaracterística. Además, SAS distingue etapas exergónicas y endotérmicas del procesoglobal, señalando un mínimo local de energía correspondiente con la formación de la acuna. Se prevé que este modelo pudiera ser útil no sólo para AS sino para otras proteínasamiloideas “intrínsicamente desordenadas” asociadas a enfermedades neurodegenerativassimilares, abriendo la posibilidad de la existencia de un mecanismo común y unificado. Esta tesis doctoral involucra un estudio desde lo sintético orgánico y la biofísica estructural,utilizando microscopias de alta resolución y herramientas fluorescentes avocadas al estudioy la descripción del proceso integro de agregación de AS, obteniendo nuevos datosrelevantes al área que son interesantes de continuar y ser explorados por el aporte quepuedan rendir en el contexto biomédico.
Abstract:
Parkinson's disease (PD) is the most common neurodegenerative motor disorder,characterized by the presence of intra and extraneuronal amyloid protein aggregatesknown as Lewy bodies (LB). The main component of these structures is alpha-synuclein (AS), a presynaptic protein of 140 aminoacids abundant in dopaminergic brain cells,although its function is not fully understood. In its native form AS has no defined secondarystructure and can adopt multiple conformations in solution and in association with otherproteins and membranes. It is believed that LB and mature amyloid fibers (mafs) are theresult of a process of AS misfolding, self-assembly and association (where the triggerremains unknown), which are believed to play a neuroprotective role through theredistribution of the population of intermediate toxic soluble species associated with earlystages. In vitro studies of the process provide the means for controlling the conditionsunder which aggregation occurs and offer the possibility to study their dynamics so as tounderstand the underlying mechanisms. The design of new means for detecting theinvolved species in AS aggregation has high priority in order to elucidate the mechanismsof formation of these early intermediates and certain their potential role in the context of PD. This thesis describes the synthesis of fluorescent probes sensitive to changes in the polarityof their microenvironment’s which have served to monitor the process of self-assembly andassociation of AS. Such probes show a high sensitive for the early stages of the processunder study, providing a novel continuous monitoring methodology with minimalperturbation of the system. Different probes based on the family of 3-hydroxychromones (3HC) were synthesized, being organic compounds highly sensitive to changes in thepolarity of their environment. Their unique chemical structure leads to the phenomenonknown as ESIPT (‘Excited State Intramolecular Proton Transfer’), a process by which anintramolecular proton is transfered in the excited state leading two the formation of twostates with different energy levels. As a consequence, these compounds exhibit twoemission bands instead of one. The position, intensity and ratio of the bands are modifiedaccording to changes in the polarity, hydrogen-bonding potential, and acidity/basicity of themicroenvironment of the probe. The new probes are versatile reporters of AS aggregation,particularly sensitive to the early stages and species to which the highest cytotoxicity isattributed. The combination of different polarity probes have provided experimental data onthe formation and disappearance of pre-amyloid transient intermediates. Spectroscopic data for the progress curves of aggregation were complemented by analysisby Atomic Force Microscopy (AFM). Through a systematic study by AFM it was possible to identify the different species in the self-assembly process of AS, where each species wascharacterized and cataloged. Studies at different temperatures allowed the evaluation oftheir influence on the kinetics and thermodynamics of the aggregation. Incubations at lowtemperature (4°C) helped to define a local energy minimum of the aggregation coordinate,revealing a novel supramolecular species (the "acuna") with evidence that it is directlyinvolved in key steps leading to the formation of fibrillar structures. Preliminary studies on SH-SY5Y cells provided evidence that these species are cytotoxic. Through cryotransmissionelectron microscopy (Cryo-ET) structural information was obtained with subnmresolution of the so-called "latent" acunas. These studies have led to the formulation of a new sequential aggregation scheme (SAS)for AS, based on concepts of colloidal, polymers and supramolecular chemistry. SASdistinguishes 3 stages of aggregation: molecular, colloidal and fibrillar according to thefound structures, their sequential orchestrated interconversion, their transient presence (orabsence) and their particular morphology. In addition, SAS distinguishes exergonic andendothermic stages of the overall process, pointing to a specific local energy minimum. It isanticipated that this model could be useful not only for AS and PD but for other "intrinsically disordered" amyloid proteins associated with neurodegenerative diseases,opening the possibility that a common and unified mechanism may exist. This thesis features a study encompassing synthetic organic chemistry and structuralbiophysics, using high-resolution microscopy and fluorescent tools to study and describethe entire process of the in vitro aggregation of AS, obtaining new relevant data to the fieldand with implications in the biomedical context, which required and justify furtherexploration.
Citación:
---------- APA ----------
Fauerbach, Jonathan Arturo. (2013). Caracterización de las etapas tempranas de la agregación de alfa-sinucleína in vitro mediante sondas fluorescentes ESIPT y microscopia de fuerza atómica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5357_Fauerbach
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Fauerbach, Jonathan Arturo. "Caracterización de las etapas tempranas de la agregación de alfa-sinucleína in vitro mediante sondas fluorescentes ESIPT y microscopia de fuerza atómica". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2013.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5357_Fauerbach
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